Lax och fågeldöden

[kockin]

Nu behöver vi din hjälp för att nå ut med budskapet.

https://savethebaltic.wordpress.com/2017/09/27/massdod-av-lax/

Edited September 27, 2017 by kockin

[kockin]

De första svaret är i hamn ifrån Europaparlamentet. En Politiker från Finland har nu visat intresse att föra upp detta i EU högsta råd. Gällande tiaminbristen

[kockin]

En relevant fråga till sportfiskare och flugfiskare! Hur ska man kunna bli populär med info som hotar vårt intresse?

[kockin]

1 hour ago Ismo sa:

Kul att 1:a artikeln är på Engelska som jag är så bra på..kan du översätta?

Jag fixar en översättning...

[kockin]

1 hour ago Ismo sa:

Kul att 1:a artikeln är på Engelska som jag är så bra på..kan du översätta?

Jag fixar en översättning...

[kockin]

Sida 1

1

Kompletterande information för

Utbredd episodisk tiaminbrist

i norra halvklotet vilda djur

Lennart Balk, Per-Åke Hägerroth, Hanna Gustavsson, Lisa Sigg, Gun Åkerman,

Yolanda Ruiz Muñoz, Dale C. Honeyfield, Ulla Tjärnlund, Kenneth Oliveira, Karin Ström,

Stephen D. McCormick, Simon Karlsson, Marika Ström, Mathijs van Manen, Anna-Lena Berg,

Halldór P. Halldórsson, Jennie Strömquist, Tracy K. Collier, Hans Börjeson, Torsten Mörner &

Tomas Hansson

Innehåll

sidor

Kompletterande metoder

2-21

Kompletterande resultat

22-45

Blåmussla (Mytilus sp.)

22-24

Ejder (Somateria mollissima) 25-31

Anguillid ål (Anguilla spp.)

32-37

Salmoniner (Salmoninae)

38-43

Sill (Clupea harengus)

44-45

Ytterligare tillkännagivanden

46

Kompletterande figurer S1-7

47-62

Kompletterande tabeller S1-6

63-75

Kompletterande referenser

76-96

---

Page 2

2

Kompletterande metoder

Biologiskt material. De sju vilda arter som studerades i denna undersökning var blåmusslor

(Mytilus sp.), Ejder (Somateria mollissima), europeisk ål (Anguilla anguilla), American

ål (A. rostrata), atlantlax (Salmo salar), öring (S. trutta) och sill (Clupea

harengus). De representerar följande tre djurklasser: musslor (Bivalvia), ray-finned

fiskar (Actinopterygii) och fåglar (Aves). Dessutom odlad inhemska kycklingar (Gallus gallus)

med experimentellt inducerad tiaminbrist användes som en surrogatkontroll för fältet

material. Prover uppsamlades på 45 stationer i Europa och Nordamerika (fig 1, fig S1a.. -

o, tabell S1). Stationerna valdes för deras allmänna förekomst av de undersökta arterna,

och inte för rapporterad förekomst av tiaminbrist eller andra sjukdomar. På Island, begynnande

tiaminbrist hos fåglar visades av oss i en tidigare undersökning 1. Ändå,

prover samlades på Island som representant för ett område med mindre frekvent förekomst av

tiamin bristsymptom (t.ex. förlamning) bland fåglar 1. Det biologiska materialet samplades

snabbt och effektivt av ett team av erfaren personal. Vid behov, ett mobilfält

laboratorium användes för att säkerställa samma snabba provtagning av materialet på alla stationer.

Kemikalier. Bovint serumalbumin (A4378), koenzym A (C3144), 17a, 20p-dihydroxi-4-

pregnen-3-on (DHP; P6285), etoxyrorufin (E3763), a-glycerofosfatdehydrogenas

(G6751), HEPES (H4030), α-ketoglutarsyra (K1875), MgClj 2 (Ultra M2670), NaCl (S7653),

NAD + (N1511), NADH (N8129), NADPH (N7505, ≥97%), resorufin (R3257), D-ribos

5-fosfat (R7750), sackaros (Ultra S7903), tiamin (T; T4625), tiamindifosfat (TDP;

C8754), tiaminmonofosfat (TMP; T8637), triosfosfatisomeras (T2391), Tris-Cl

(T3253), Triton X-100 (T9284), Trizma ® bas (T1503), och D-xylulos 5-fosfat (15807) var

köpt från Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). DL-ditiotreitol (43819) köptes

från Fluka (Riedel-deHaën, Tyskland). Acetonitril LiChrosolv ® (1.14291.2500), kopparsulfat

pa (1.02791.0250), dikaliumvätefosfat pa (1.05104.1000), dinatriumkarbonat

pa (1.06392.1000), Folin-Ciocalteu s fenolreagens (1.09001.0500), saltsyra 30%

Suprapur (1.00318.1000), kaliumdivätefosfat pa (1.04873.1000), kalium

hexacyanoferrat (III) pa (1.04973.0250), kaliumnatriumtartrat pa (1.08087.500), och

triklorättiksyra (TCA) pa (1.00807.1000) köptes från Merck (Darmstadt,

Tyskland). Etylacetat, Baker-analyserad (9282-03), dikaliumvätefosfat, vattenfri

(0241), hexan, Baker-analyserad (8088) och natriumhydroxid, Baker-analyserad (0402) var

köpt från JT Baker (Deventer, Nederländerna). Mayers hematoxylin (01820) var

köpt från Histolab Products AB (Göteborg, Sverige). Natriumhydroxid, EKA-pellets

(1,3303-1) köptes från AkzoNobel (Bohus, Sverige). Salmonhypofysekstraktet (SPE) var

köpt från Argent Laboratories (Redmond, WA, USA). Heparin 100 IE / KY / mL och

5000 IE / KY / mL köptes från LEO Pharma (Malmö, Sverige). Tricain-metansulfonat

(Tricaine-S, MS-222) köptes från Western Chemical, Inc. (Ferndale, WA, USA). Eosin

(B381402) och Luxol fast blue (B381750) producerades hos Veterinärinstitutet

(Uppsala, Sverige). Alla andra kemikalier köptes från gemensamma kommersiella källor och

var av analytisk renhet. Rent vatten producerades av ett cyklon 4BD-vatten som fortfarande är dubbelt destillerat

(Fistreem International Ltd., Loughborough, Storbritannien) eller ett Milli-Q Integral 3-system (Thermo Fisher

Scientific Inc., Waltham, MA, USA).

---

Page 3

3

Blå musslor. Systematiskt består blåmusslor av minst tre närbesläktade taxa som kallas

de Mytilus edulis komplex 2. De huvudsakliga komponent taxa är M. edulis, M. trossulus, och M.

galloprovincialis. Sammantaget befolker de båda Atlanten, inklusive

Östersjön liksom andra delar av världen 3. Komponent taxa har visat sig hybridisera

med varandra, när de är närvarande på samma ort 2,4,5. Till exempel Östersjön och svenska

västkusten befolkas av både M. edulis och M. trossulus, liksom hybrider av två 5.

Hybridisering har nyligen underlättats av mänskliga aktiviteter, såsom frakt (ballastvatten),

varigenom taxa har introducerats till nya områden. Sedan de taxonomiska relationerna inom

Mytilus edulis komplexet är fortfarande under vetenskaplig debatt, och vi har inte analyserat vår samplade

blåmusslor genetiskt, hänvisar vi till dem helt enkelt som Mytilus sp. Blå musslor samlades in

manuellt med handnät och / eller med ett 30 cm brett trål som hanteras av ett rep från en liten båt. I

Island (regionerna A-D), blåmusslor samlades på ett djup av ner till 1 m under det lägsta

tidvattnet varje särskild dag (dvs. exemplar periodvis utsätts för luft undveks). Det enda

undantag var 21 blåmusslor samlade på 7,0 m djup vid A4 vecka 25 2013. I Sverige blå

musslor samlades in i regionerna F, G och I. Alla blåa musslor från G1 samlades in inom a

ett område på ca 40 m längs stranden och vid ett djup av ca 1,5 m. G1 är en smal och grund naturlig

sträckan mellan två större vattenbassänger. Strömmen genom sträckan ändrar riktningen med

oregelbundna intervaller om en halvtimme upp till några timmar, på grund av lokala skillnader i atmosfäriska

tryck. (Det finns nästan ingen tidvattnet i Östersjön vid denna latitud.) Nuvarande verkar vara

fördelaktigt för de blåa musslorna, eftersom de var rikligare på G1 än på andra ställen i regionen

G, åtminstone 2011 då vår provtagning startade. I regionerna F och I måste blåa musslor samlas in

inom djupområdet 1,0-8,5 m eftersom de inte var närvarande vid alla djup. För en verifikation

experiment, vattenbruk blå vattenkvistar samlades också på den svenska västkusten. Inom några

timmar, de blåa musslorna transporterades till laboratoriet i en termo-isolerad plast 30 L-låda

fylld med vatten från samlingsplatsen.

Kontroller av blåmusslorverifiering. Dessa experiment utfördes för att verifiera att

analys av transketolas (TK) aktivitet och latens som biomarkörer av tiaminbristverk

även i blåmusslor, eftersom detta inte har visats tidigare. För att artificiellt framkalla

tiaminbrist i laboratoriet, vattenbruk från blågrödor från den svenska västkusten

inkuberades i luften vid rumstemperatur i fem dagar. Sådan behandling har visats

att framkalla oxidativ stress 6, vilket troligen orsakade den observerade tiaminbrist i vår

blåmusslor för vattenbruket. Efter denna behandling återvände de till havsvatten från

uppsamlingsplats vid fälttemperatur i 16 h för att delvis återvinna innan provtagning. Deras matsmältningskörtel

delades längs i två lika stora halvor (vänster och höger). En hälften användes för TK-analys och

den andra hälften användes för tiamin kvantitering. Ett motsvarande experiment utfördes med

blå musslor från G1. Dessa prover fördelades slumpmässigt till experimentgrupperna. De

inkuberades i luften vid rumstemperatur under två dagar (medelstress) eller fyra till fem dagar

(maximal spänning), varefter de återvände till bräckt vatten från insamlingsstället vid fält

temperatur i tre dagar (medelstressgrupp) eller en dag (maxstressgrupp) till delvis

återhämta sig före provtagning. En kontrollgrupp av icke-inkuberade G1 blåmusslor samplades också. I

detta experiment hela matsmältningskörteln användes för TK-analys.

Provtagning av blå musslor. Vid varje provtagningstillfälle samlades ca 24 prover inom a

några timmar efter ankomsten till laboratoriet. Denna grupp, kallad "gemensam ädermat", var senare

analyseras för tiamin för att bestämma hur mycket tiamin den gemensamma ägaren faktiskt erhåller

---

Page 4

4

från sitt stora byteobjekt. En annan grupp av ca 18 prover lämnades över natten för avföring vid

samma temperatur som var de samlades in. Ursprungligen ett kontrollexperiment för detta

behandling utfördes, där matsmältningskörteln analyserades för aktivitet och latens av TK,

och varigenom ingen effekt av övervakning över natten och avföring observerades. Vid provtagning,

proverna blöts lätt på en pappersvävnad och vägdes (totalvikt inklusive skal och

inom vatten) till närmaste 0,01 g. Längd, bredd och höjd av varje prov mättes sedan

med en elektronisk digital calliper till närmaste 0,1 mm. För att undersöka storleksskillnader, alla

blåmusslor, förutom de från den svenska västkusten, klassificerades med längden som antingen små

(15 <längd <23 mm), medium (23 <längd <27 mm) eller stor (27 <längd <38 mm). I den samlade

Material från Östersjön och Island var 80% (2 100 av 2 640) av proverna 19-31 mm

lång. "Common Eider Food" -gruppen innehöll vanligen 6 små, 12 och 6 stora

prover, medan gruppen "avföring" vanligtvis innehöll 6 exemplar av varje längdsklass.

Följaktligen fanns en jämn fördelning av längder inom intervallet 19-31 mm. I

"Gemensam ätermat" -grupp öppnades varje prov genom att avlägsna adduktormusklerna med

en lansett, och den mjuka kroppen dissekerades, släpptes lätt på en pappersvävnad, vägde till närmaste

0,01 g, sättes i ett kryotube, nedsänkt i flytande kväve och lagras vid -140 ° C tills tiamin

kvantifiering. I "defecation" -gruppen öppnades varje prov genom att skära av adduktorn

muskler med en lansett och matsmältningskörteln dissekerades med pincett och ett par oftalmiska

sax (Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Tyskland) under ett Leica MZ8 stereomikroskop

(Leica Microsystems GmbH, Wetzlar, Tyskland), lätt blottad på en pappersvävnad, vägd till

närmaste 0,01 g och homogeniseras i 400 | il iskallt 0,25 M sackaros i en 500 | il Potter-Elvehjem

homogenisator (storlek 18) med fyra upp- och nedslag vid 400 rpm och under konstant kylning med

isvatten. Homogenatet utspäddes med en annan 400 | il iskall 0,25 M sackaros, överfördes

till en 2 ml Eppendorf-rör och centrifugerades vid 10 tusen g AV och 4 ° C under 10 min i en Eppendorf

5415R centrifug (Eppendorf, Hamburg, Tyskland). Alikvoter av supernatanten infördes

cryotubes, nedsänkt i flytande kväve och lagras vid -140 ° C till analys av TK-aktivitet och

latens. Förvaring vid denna ultra-låga temperatur är ett viktigt försiktighetsåtgärd, särskilt för

bevarande av apoenzymen, som kan vara mindre termostabil än holoenzymerna. De

Den återstående mjuka kroppen av varje prov dissekerades och bearbetades på samma sätt som det mjuka

organ av gruppen "gemensam ätermat". Provtagningen av varje prov utfördes utan

avbrott, även om två prover ibland samlades parallellt. För att underlätta

jämförelse med blå musslor som beskrivs i litteraturen, vi samplade också ytterligare blå musslor

från G1 för bestämning av mjuk kropps torr vikt. Under 2011-2014, vid åtta tillfällen slumpmässigt

fördelat över året samlades 30 ytterligare blå musslor för detta ändamål (totalt 240

prover). De dissekerades på samma sätt som exemplen på "gemensam ätermat"

grupp.

Torkviktbestämning och beräkning i blåmusslor. Mest publicerade tidigare

mätningar av blåmusslor medför bestämning av mjuk kropps torrvikt. Både tiamin

koncentration och TK-aktivitet och latens är emellertid termolabila och kan inte mätas i

torkat material. Därför bestämde vi den genomsnittliga mjuka kroppens torra viktproportion i 240

ytterligare blå musslor från G1 samplades för detta ändamål. Proverna torkades vid 95 ° C för

24 h, fick svalna i en uttorkare och vägdes till närmaste 0,01 g. Den genomsnittliga mjuka kroppsdrogen

viktprocenten hade ett intervall av 13,4-16,8%, och det var inget mönster i variationen över

år. Därför använde vi en stor medelvärde på 14,9% för beräkning av hela Östersjöns torrvikt

blå musslor som inte torkades, oavsett årstid. I undersökningarna av

---

Sidan 5

5

Kautsky 7 och Öst & Kilpi 8, tork utfördes vid 60 ° C under 48 h. Därför jämförde vi

två torkningsregimer i ett kontrollexperiment där de blåa musslorna (n = 30) torkades först vid

60 ° C i 48 timmar och vägdes och torkades sedan vid 95 ° C under ytterligare 24 h och vägdes igen. De

95 ° C torkningsreglering gav en 4,4% lägre torrvikt än 60 ° C torkningsregimen (67,9 ± 11,7 mg

i stället för 71,3 ± 12,6 mg). Denna skillnad är för liten för att få någon betydande inverkan på

jämförelse av våra resultat med de Kautsky 7 och Öst & Kilpi 8. För att matcha längden

grupper 20 mm och 30 mm som definieras av Kautsky 7, två längdgrupper betecknade 21 mm och 29 mm

bestod av blå musslor från G1. De bestod av prover i längdintervallen 17-

23 mm respektive 27-33 mm.

Body Condition Index (BCI) för blå musslor. För att möjliggöra analys av tiamin och TK i blått

musslor (ingen torkning) definierade vi BCI som den våta mjuka kroppsvikten (g) dividerat med det totala provet

volym (cm3). Den totala provvolymen beräknades som produkten av provlängd, bredd,

och höjd, och en empiriskt bestämd konstant, som tog värdena 0,45 i Östersjön,

0,46 i Island och 0,39 vid den svenska västkusten (45-90 mm långa blåmusslor). Konstanten

beräknades utifrån den totala vikten av prov som fylldes fullständigt med vatten i början av

provtagningen, med hänsyn till vått skalvikt och densitet, vattentäthet och våt mjuk kropp

densitet. Den genomsnittliga våta skaldensiteten beräknades från det våta skalets vikt och volym. De

våt skalvolymen bestämdes genom nedsänkning av flera skalhalvor i vatten i en graduerad

cylinder. Den genomsnittliga våta skaldensiteten var 1,14 g / cm³ i Östersjön, 2,40 g / cm³ på Island och

2,47 g / cm³ vid den svenska västkusten. Den våta mjuka kroppstätheten antogs vara 1 g / cm3.

Klorofyll a i region G. data på klorofyll en koncentration i region G erhölls från

databasen Svenskt HavsARKiv (SHARK) som tillhandahålls av Meteorologiska och Svenska

Hydrologiska institutet (SMHI). Uppgifterna producerades inom svenska samordnade

Miljöövervakning av Naturvårdsverket (SEPA). De

klorofyll en koncentration vid 2,5 m djup beräknades som det aritmetiska medelvärdet av de värden som

0 och 5 m djup. För klorofyll en bestämning, vatten uppsamlades med en 5 L Niskin vatten

provtagare. Inom 16 timmar filtrerades en volym av 1-2 liter på ett 47 mm Whatman GF / F filter i reducerat

ljus. Efter filtrering sattes 3 ml 1% magnesiumhydroxidkarbonatsuspension per liter prov

sattes till filtret, vilket lagrades vid -20 ° C till analys (ej längre än 3 månader).

Klorofyll en extraherades med etanol vid rumstemperatur i mörker under 6-24 timmar. Under detta

tiden skakades grundligt åtminstone tre gånger och en gång till före centrifugering.

Provet centrifugerades två gånger vid 2 950 rpm i 5 min. Klorofyll a Absorbansen mättes

med en Hitachi U-2000 spektrofotometer (Hitachi, Tokyo, Japan) vid 664 nm och korrigerad för

bakgrund vid 750 nm. Klorofyll en koncentration beräknades enligt formlerna

definieras av Jeffrey och Humphrey 9. Prover uppmättes i duplikat, normalt från samma

Niskin vattenprovtagare efter noggrann blandning av provet. Ett certifierat referensmaterial,

bestående av en känd mängd av klorofyll en löst i aceton, analyserades minst två gånger

år. Vidare analyserades ett laboratoriereferensmaterial (LRM) parallellt med proven

vid varje tillfälle. LRM bestod av klorofyll extraherad med etanol eller aceton och var

lagrad vid -20 ° C.

Vanliga ägare. På det europeiska fastlandet är den gemensamma ägaren en migrerare med kort avstånd,

medan på Island är det en icke-invandrare. Flera undersökningar har visat att blåa musslor är

en viktig del av den gemensamma ejder diet t.ex. 8,10-15. Den föredragna längden av de blåa musslorna i

---

Page 6

6

dessa undersökningar varierade något mellan platser: 8-28 mm (medel ca 17 mm) i norra

Östersjön 8; 30-40 mm i Kattegatt 10; 16-41 mm (medel ca 27 mm) i mellersta Skottland i

November-12 februari; betyder 23 mm i nordöstra Skottland 14; och 5-29 mm (medelvärde 14 mm) i

norra Norge 16. Följaktligen samlades de blåa musslorna ur oss, inom huvudlängdsintervallet

19-31 mm, var väl representativa för den gemensamma ätermat.

Provtagning av vuxna gemensamma äldrehunner. Totalt 23 vuxna gemensamma äldre kvinnor var

samplades i region I under uppfödningssäsongen 2011. Ett motsvarande material av 12 exemplar

samlades i regioner C och D 2013. Honorna fångades med ett stort handnät medan

inkubera sina avkommor i boet. Honan och hela dess bo (inklusive ägg och / eller pulli)

placerades i en djurtransportlåda och fördes till laboratoriet och samlades inom några timmar

efter insamling. Det är vårt intryck att detta förfarande, för att inte skilja kvinnan från sitt bo

och avkomma, höll kvinnan lugnare än vad den annars skulle ha varit. Medan du väntar på att vara

sampled, en av kvinnorna från region I dog av en massiv hjärtattack, som bestämdes av post-

mortem undersökning. Detta är särskilt intressant, eftersom hjärtsvikt kan orsakas av

tiaminbrist 17. (Eftersom det här provet hittades dött någon gång efter hjärtinfarkten var det

uteslutet från provtagningen.) Varje prov avfickades och vägdes till närmaste 1 g. De

erhållna vikter justerades senare för förlust av blod vid avkapning genom multiplikation med a

faktor av 1,03 18. Lever och hjärna dissekerades och vägdes till närmaste 0,01 g. För tiamin

kvantifiering, ett leverstycke och den högra halvan av hjärnan sattes i kryotor, nedsänkt i vätska

kväve och lagras vid -140 ° C till analys. För analys av tiaminberoende enzymer a

Den centrala delen av levern skars i mindre bitar med ett sax och homogeniserades i en

lika stor mängd iskall 0,25 M sackaros i en 10 ml Potter-Elvehjem-homogenisator (storlek 21) med

fem upp och ner slag vid 400 rpm och under konstant kylning med isvatten. Homogenatet

späddes till 20% med iskall 0,25 M sackaros, överfördes till 2 ml Eppendorf-rör, och

centrifugerades vid 10 tusen g AV och 4 ° C under 10 min i en Eppendorf 5415R centrifug (Eppendorf,

Hamburg, Tyskland). Supernatanterna blandades och alikvoter sattes i kryotor, nedsänktes

i flytande kväve och lagras vid -140 ° C till analys av TK-aktivitet och latens. De återstående

pellets i 2 ml Eppendorf-rören nedsänktes i flytande kväve och lagrades vid -140 ° C tills

analys av a-ketoglutarat dehydrogenas (KGDH) aktivitet och latens. Den vänstra halvan av hjärnan

tilldelades också till analys av tiaminberoende enzymer. Hjärna 10.000 g AV-supernatanter och

pellets framställdes på samma sätt som för leverbitarna. Prov för histopatologiska

undersökning dissekerades från levern, myokard, njure, bukspottkörtel, tarm, lunga, äggstock,

och lårmuskel och fixerad i 10% neutral buffert formalin. Inga histopatologiska prover av

hjärnan togs, eftersom hela hjärnan måste allokeras till analys av tiamin och tiamin-

beroende enzymer. Denna procedur var nödvändig för att prova hjärnan på exakt samma

sätt som för andra fågelprover. Perifera nerver och ganglier var emellertid närvarande i den andra

vävnadsprover och inkluderades således i den histopatologiska analysen. Provtagningen av varje

provet utfördes utan avbrott och slutfördes innan nästa prov var

dekapiterade och provtagna. Resten klassificerades av antalet ner i kategorierna

"Normal" (50-100%), "mindre än normalt" (5-50%) och "mycket mindre än normalt" (0-5%), där

100% representerar ett bo fullt möblerat med nere. Några ägg fylldes och / eller innehöll en död

embryo eller foster. Procentandelen av sådana ägg i varje koppling registrerades.

Provtagning av vanliga äggägg. 207 vanliga äggägg samlades på Island (regionerna A-

D) 2005-2013. Endast nylagda ägg användes, och kriteriet för detta var frånvaro av blod

---

Sidan 7

7

kärl. Äggen vägdes till närmaste 0,01 g och längd och bredd mättes med a

Vernier calliper till närmaste 0,1 mm. I hushållens kycklingägg är äggkoncentrationen T mer

än tio gånger den vita T koncentration på våt viktbasis 19,20, och i äggulan, både plasma

och granuler innehåller signifikanta mängder av T 21. Liknande förutsättningar antas i vanlig ägarna

ägg. Därför samlades äggulor med en 2 ml spruta (utan nål) för att undvika

förorening med vit, och läggs i cryotubes, som nedsänktes i flytande kväve, och

förvaras i flytande kväve (prover från 2008-2009) eller vid -140 ° C (återstående prov) tills

tiamin kvantitering. Ägg viktminskning på grund av vattendunstning mellan läggning och provtagning var

erhållen som skillnaden mellan initialvikt och uppmätt vikt. Den ursprungliga vikten

beräknades utifrån den färska äggtätheten (bestämd av oss) och volymen, vilken var

beräknad 22 från längd, bredd, och en form med konstant 23. Tolkningskoncentrationen Tolkning justerades för

vattenförlusten, med användning av en litteraturvärde 24 av innehållet äggula vatten, varvid den relativa minskningen

i äggula var vattenhalten approximerad av den relativa äggvattenförlusten. Äggvattenförlusten var

i allmänhet 0-10% av den ursprungliga äggvikten, vilket resulterar i en 0-5% justering av äggulaen T

koncentration, eftersom ca hälften av äggulan var vatten.

Avel ejder undersökning i region F. Lygne skärgård ligger i utkanten

av Stockholms skärgård. Det totala arealet är 1,3 km², varav 0,2 km² är mark, fördelat på

ett antal relativt små öar av olika storlekar. Växtligheten, som är koncentrerad till

större öar, kännetecknas av låga träd, såsom björk, rowan och alder, och markskydd,

såsom krypande enbär, lyng, krusbär och träskfragment. Stränderna är huvudsakligen

bestående av platta stenar, stenar och ibland en liten äng. Lygne skärgård har

har förmodligen varit en plats för fiske och jakt sedan medeltiden eller ännu längre. Det finns

spår av bosättningar av säsongsbetonade invånare. Sedan mitten av 1800-talet har fågelbestånden varit

regelbundet övervakas, även om tillförlitliga kvantitativa uppgifter om antalet gemensamma äderboskap är

tillgänglig endast 1910 och framåt. Denna undersökning, som är utan parallell i Sverige, var

utfördes med relativt jämnt intervall (mest tre år), och det var bara omöjligt att ta hand om det

bon byggt innevarande år, att döma av bland annat förekomsten av äggskal och / eller nedåt. 1953, den

Lygne Archipelago grundades som ett vilt- och fågelskyddsområde av Stockholms län

Styrelsen. År 1983 begränsades fågelskyddsområdet av samma myndighet till

12 öar inom Lygne skärgård med förbud mot att gå närmare en ö än

100 m utanför stranden under 1 april till 31 juli. Minkfällor och jakt med hundar har hållit området

mestadels fri från mink. Trots höga naturliga och rekreationsvärden är Lygne Archipelago

sparsamt besökta av turister, kanske totalt ca 30 kortvariga båtar under en solig sommar.

Följaktligen är det mänskliga trycket på området relativt lågt. Den avel gemensamma ägaren

undersökningskurva som presenteras här inkluderar endast de 28 stationer som övervakades genom hela

hela perioden från 1910 till 2016. Räkningen av boet måste betraktas som en mycket tillförlitlig

metod i jämförelse med många andra metoder för övervakning av fågelpopulationer.

Inhemska kycklingförsök. Tre inhemska kycklingsexperiment med olika doser av T i

maten utfördes som en surrogatkontroll för effekter av den tiaminbrist som observerades i

biologiskt material från fältet. Trots artskillnader finns det många likheter i

fysiologiskt svar på tiaminbrist, vilket gör jämförelsen mellan arter gällande. Nytt

kläckta hönakyllor (SweHatch, Väderstad, Sverige), som väger ca 40 g, fick a

tiaminfrit hushållsfoder (Special Diet Services, Essex, Storbritannien), kompletterat (av oss)

med T vid olika doser. Det tiaminfria foderet hävdades innehålla <0,4 nmol tiamin per

---

Sidan 8

8

g av tillverkaren, och vår egen analys bekräftade att den innehöll <0,1 nmol T per g,

<0,1 nmol TMP per g och <0,3 nmol TDP per g. För alla andra näringsämnen uppfyllde foderet

Kostbehov för hushålls kyckling enligt vad som anges i "Nutrition Requirements of Poultry, Ninth

Reviderade upplagan, 1994” 25. Vatteninnehållet i torrt foder var 8,3%. Experimentella grupper

matchades med avseende på startvikt och annars randomiserad. Alla experimentella grupper

parades i förhållande till den lägsta dosgruppen för att säkerställa att alla grupper fick samma mängd

av mat. Experimenten avslutades när de lägsta dosgrupperna började visa kliniska

symtom på tiaminbrist. I det första experimentet var målet att producera referensvärden

för de undersökta diaminbristbiomarkörerna för jämförelse med den vuxna kvinnliga vanliga

ejdrar. Experimentet inkluderade en "bristfällig" grupp, givet en T-dos (nmol / g torrt foder) av antingen

0,9 (n = 7) eller 1,5 (n = 8) och en "komplett" grupp, ges en T-dos av antingen 10 (n = 7) eller 25 (n = 7). De

motiveringen att ha en mängd T-doser i varje grupp var att uppnå en mer relevant jämförelse

med de vuxna kvinnliga gemensamma ägarna. Dessutom valdes dosintervallet 0,9-1,5 nmol / g till

få tydliga symptom på tiaminbrist på den biokemiska nivån. På sekunden

experiment, syftet var att producera en dos-respons-kurva för den undersökta tiaminbristen

biomarkörer. De inkluderade T-doserna (nmol / g torrt foder) var 0,3 (n = 8), 0,9 (n = 15), 1,5 (n = 8), 2,5

(n = 8), 5 (n = 7) och 10 (n = 7). För histopatologisk analys utfördes ett tredje experiment,

där inhemska kycklingar (n = 9) fick det tiaminfria foderet utan något tillägg av T.

I försöket en och två utfördes provtagningen på dag 11 och 12 när de inhemska kycklingarna

hade ökat med 0-50 g, medan i det tredje experimentet utfördes provtagning på dag 10. Alla

Inhemska kycklingar samplades på samma sätt som de vuxna kvinnliga gemensamma ägarna, förutom det

proverna för histopatologisk undersökning dissekerades från hjärnan, levern, myokardiet,

njure och kalvsmuskler.

Kroppsindex för fåglar. Ett kroppsförhållandeindex (BCI) definierades som kroppsvikt (hg) uppdelat

av hjärnvikt (g). Ett leverkroppsindex (LBI) definierades som levervikten uttryckt som

procent av kroppsvikt.

Europeisk och amerikansk ål. De europeiska och amerikanska ål har fem olika livssteg:

leptocephalus, glasål, älv, gul ål och silverål. Gytning har föreslagits att förekomma i

Sargassohavet 26-28 och leptocephali delvis simma och delvis driva med strömmarna till

Europeiska och amerikanska kusterna. Tiden för denna resa har uppskattats till minst 8-9 månader

och upp till tre år för den europeiska ålen 29-31. Omgivningens omfattning och natur under detta

tiden är i stor utsträckning okänd, även om gelatinösa marina plankton, så kallad marinsnö, har varit

föreslås ingå i kosten 32. Vid ankomsten till kusten, den leptocefaliska metamorfosen

i halvgenomskinliga glasålar, som kan finnas kvar i mynningen i upp till ett år 33. Under detta

tid, glasål börjar successivt förvandlas till glasål, som migrerar längre uppströms 33 in i

eller nära sötvatten habitat 34. Elverstadiet följs av den gula ålstadiet, vilket kan

pågå i 3-30 år 29,35,36. Detta skede är en period av matning och tillväxt 34, som avslutas med

omvandling av de gule ål till silverål, när de är redo att börja sin migrering tillbaka

till Sargassohavet för att leka 37,38. För den europeiska ålen, 39 har denna resa 5000-6000 km

uppskattats att ta fyra till åtta månader med en topp vid sex månader 40. För den amerikanska ålen, den

migration resan är 1000-5000 km 41 och kan ta två till sex månader, baserat på migration start

i augusti till december 41 och topp lek i februari 30. Förvandlingen av gula ålar in i

silver ålar är förknippade med omfattande fysiologiska förändringar. Förutom förändringen i

pigmentering, finns det en ökad syntes av tillväxthormon (GTH-II) genom hypofysen 42,43, och

---

Sidan 9

9

Gonaden börjar växa. Kvinnliga europeiska silverål togs på H1, I9 och J1 i Sverige i

tidigt hösten 2012 och 2013. Deras gonadosomatiska index (GSI, definierat nedan) var 1,1-1,9%.

Sådana höga värden förekommer nästan uteslutande (till ca 99%) i silver ålar 43,44. Detta kriterium tillsammans

med den morfologiska egenskaper längd, vikt, ögondiameter 45, och pigmente försäkrade

att de samlade kvinnliga europeiska ålerna med stor sannolikhet var korrekt klassificerade som silver

ål. European elvers fångades på L1 i Storbritannien i slutet av april 2013. Detta område och dess prevalens

av europeisk ål har beskrivits i detalj av Aprahamian 46,47. Juvenile ål var

otvetydigt pigmenterad och därmed anses ha nått Elver stadiet 48,49. Kvinna amerikanska

Silverålen fångades på N1 (MA, USA) och O1 (QC, Kanada) hösten 2011, medan

Amerikanska gula ålar fångades som glasål på M1 (MD, USA) år 2010. Både i Sverige och

USA, silver ålar fångades med olika typer av ål fällor på olika platser. Fällorna

var också belägna i olika miljöer (t.ex. i en flod eller i en sjö). Som ett resultat fällorna

skilde sig i fiskeeffektivitet (t ex med avseende på simning aktiviteten hos ålar). Det här kanske

har orsakat en förspänning i ålernas tiaminstatus och som en försiktighetsåtgärd, inga jämförelser av

Tiaminstatus gjordes mellan regioner inom Sverige. Både den europeiska elversen och

Amerikanska glasålar fångades med ett handnät. På grund av den uppenbara svårigheten att fånga

gytning kvinnliga silver ålar med ägg i Sargassohavet, äggproduktion inducerades av

gonadotropinbehandling av kvinnliga amerikanska silverål i laboratoriet för att erhålla information

om överföringen av tiamin till ägget. De europeiska elverna användes i ett experiment där

effekten av tiaminbehandling på biomarkörer av tiaminbrist undersöktes. De

Amerikanska gulål användes i ett experiment där effekten av tiamin status

simning uthållighet undersöktes.

Ål simma parasit blåsan. Undersökningen av kvinnliga europeiska blankål ingår räkna

av simblåsa parasit Anguillicola crassus , vilket är en nematod. Denna parasit har varit

påstås komma från Sydostasien 50 och det observerades inte i Västeuropa till

tidiga 1980-talet 51 . Det rapporterades för första gången i Storbritannien 1987 52 , och i Sverige den beskrevs

som en ny parasit i 1988 53 . Från mitten av 1990-talet, har det visat sig även i amerikanska ål i North

America 54 . Livscykel A. crassus innefattar små hoppkräftor som mellanvärdar, andra fiskar

som fakultativa reservoar värdar och anguillid ålar som slutliga värdar 55 . I ytterkanten med 37 A. crassus var

utelämnas, eftersom antalet denna parasit i alla andra europeiska blankålar var i intervallet 0-

14.

Kvinna Europeiska blankål provtagning. Varje prov av blankål placerades upp och ned

i en avlång, V-formad låda av plywood och som innehas av två personer. I detta läge, var den totala längden

mätt till närmaste 1 cm, och ett blodprov togs från svansvenen med en

hepariniserat (100 IE / KY / ml) 2 ml spruta, vände försiktigt flera gånger för att förhindra att blodet

koagulering. Provet halshöggs och vägdes (inklusive huvudet) till närmaste 1 g. Medan

kropp fortfarande innehas av två personer, lever, hjärta, gonad och hjärna dissekerades och vägdes till

närmaste 0,01 g. Hjärnan var så liten (0,07-0,17 g) att den helt och hållet tilldelades antingen

tiamin kvantifiering eller analys av TK och KGDH. De otoliter dissekerades för ålder

bestämning. För tiamin kvantifiering, bitar av levern och epaxial vita muskler, liksom

hela hjärtat, och för ca hälften av proverna var hela hjärnan sätter i kryorör, nedsänkt

i flytande kväve, och lagrades vid -140 ° C fram till analys. Antalet A. crassus registrerades.

För analys av tiamin-beroende enzymer, var en central del av levern skars i mindre bitar

med en sax och homogeniserades i en lika stor volym av iskall 0,25 M sackaros i en 10 ml

---

Sidan 10

10

Potter-Elvehjem-homogenisator (storlek 21) med fem slag upp och ned vid 400 varv per minut och under

konstant kylning med isvatten. Homogenatet späddes till 20% med iskall 0,25 M sackaros,

överfördes till 2 ml Eppendorf-rör och centrifugerades vid 10.000 g AV- och 4 ° C i 10 min i en

Eppendorf 5415R centrifug (Eppendorf, Hamburg, Tyskland). Supernatanterna blandades och

alikvoter ställdes i kryorör, nedsänkt i flytande kväve, och lagrades vid -140 ° C till analys

av TK-aktivitet och latens. De återstående pellets i de 2 ml Eppendorf-rör nedsänktes i

flytande kväve, och lagrades vid -140 ° C tills analys av KGDH aktivitet och latens. För ca hälften av

proverna, 10.000 g AV- supernatanter och pelletar av hela hjärnan framställdes på samma

sätt som för levern bitar. Försiktighetsåtgärden att lagra proverna för enzymatisk analys vid -140 ° C

specifikt motiveras av det faktum att värmestabiliteten av apoenzym har varit

visat sig vara lägre än den för holoenzymet för TK i den europeiska ål 56 . Blodsocker,

hemoglobin och hematokrit uppmättes i duplikat direkt vid provtagningen. Blodsocker

mättes med HemoCue ® Glucose 201 RT System (HemoCue AB, Ängelholm, Sverige),

baserat på de metoder som presenteras av Banauch et al . 57 och Bergmeyer 58 . Hemoglobin mättes

med HemoCue ® Hb 201 + System (HemoCue AB, Ängelholm, Sverige), baserat på metoden

presenteras av Vanzetti 59 . Hematokrit bestämdes enligt standardförfarandet för

hematokrit centrifugera Haemofuge nr. 780 (Heraeus Christ, GmbH, Osterode, Tyskland). Ett glas

kapillär, fylld med ca 24 mikroliter blod, centrifugerades under 2 min och avlästes med en hematokrit läsare.

Provtagningen av varje prov genomfördes utan avbrott och avslutas innan nästa

prov togs som prov. Ålder bestämdes från otoliter enligt ”ICES WKAREA

Report 2009” 60 . Det är brukligt att hänvisa till en ålder av ål i sötvatten i form av år post

metamorfos 49 . Således en Elver är ålders noll.

Europeiska Elver experiment och provtagning. De glasål var ett prov från en stor sats importerad

till Sverige av Scandinavian Silver Eel AB (Helsingborg, Sverige). De var 6-8 cm långa och

vägde 0,17-0,40 g när de anlände till vårt laboratorium på dag ett. De var alla i till synes

gott skick, simning kraftigt och det fanns ingen dödlighet. I efterhand var vi

informeras om att resten av partiet importerades till Sverige inte utvecklar några sjukdomar eller dödlighet

i den obligatoriska karantän, från vilken den experimentella provet var befriad. De glasål var

erbjuden torsk ( Gadus morhua ) rom under försöket, men inte äta. De

glasål indelades slumpmässigt i de experimentella grupperna. Totalt 24 obehandlade prover

prov på dag två och fyra ytterligare obehandlade prover prov på dag tio. En summa av

12 prover badades två gånger (dag fem och åtta) i 2 L av en 100 mg / LT, lösning 48 h varje

tid. De tiamin behandlade proverna prov på dag tio. Det fanns ingen dödlighet under

experimentera. Varje prov vägdes till närmaste 0,01 g och dekapiterades. För analys av TK,

levern dissekerades i en petriskål på is under ett Leica MZ8 stereomikroskop (Leica

Micro GmbH, Wetzlar, Tyskland). Levern homogeniserades i 300 | il iskall 0,25 M

sackaros i ett 500 pl Potter-Elvehjem-homogenisator (storlek 18) med fem slag upp och ned vid

400 rpm och under konstant kylning med isvatten. Homogenatet späddes ut med en annan

400 | il iskall 0,25 M sackaros, överfördes till en 2 ml Eppendorf-rör och centrifugerades vid

10 tusen g AV- och 4 ° C under 10 min i en Eppendorf 5415R centrifug (Eppendorf, Hamburg,

Tyskland). Alikvoter av supernatanten ställdes i kryorör, nedsänkt i flytande kväve, och

lagrades vid -140 ° C tills analys av TK-aktivitet och latens. För tiamin kvantifiering, den

decapitated kropp resten vägdes till närmaste 0,01 g, placeras i kryorör, nedsänkt i flytande

kväve, och lagrades vid -140 ° C fram till analys. Provtagningen av varje prov utfördes

utan avbrott och slutföras innan nästa prov togs.

---

Page 11

11

American gulål simning uthållighet experiment och provtagning. Initialt, totalt 30

prover delades slumpmässigt in i två grupper, ”fylld” och ”bristfällig”. Grupperna var

placeras i två cylindriska genomströmnings bassänger, som var 60 cm i diameter och hade ett djup av

28 cm. Vattentemperaturen hölls vid 19 ° C och flödet bibehölls vid 6,5 l / min under

loppet av experimentet. Den ”fylld” grupp matades en basal fiskmjöl diet kompletterad

med ca 38 nmol T per g, medan den ”deficient” grupp ursprungligen matas med samma basdiet

kompletterat med bakteriell thiamin och ingen T. Den sistnämnda diet har tidigare använts för att

inducera tiaminbrist i insjööring ( Salvelinus namaycush ) 61 . Den ”bristfällig” gruppen var

upprätthålls på denna diet tills proverna började visa tecken på tiaminbrist, såsom

okoordinerade simning och dödlighet, parallellt med låga muskel tiamin koncentrationer. Några

prover, både med och utan okoordinerade simning, provtogs för bekräftelse av

låga muskel tiamin koncentrationer. Dessa prover dödades med en överdos av MS-222

följt av cervikal dislokation. Muskelvävnad var omedelbart dissekerades och lagrades vid -80 ° C

tills tiamin kvantifiering. Vid denna tidpunkt var dieten ändrades till basal diet kompletterad med ca

1,5 nmol T per g och utan bakterie thiamin. Denna dietary T koncentration förhindrar mortalitet

men upprätthåller en låg tiamin status i proverna 62 . De gula ålar hölls under

dessa villkor för över ett år och de vägde minst 20 g vid tidpunkten för simning

uthållighets experiment. På grund av provtagning och dödlighet fanns 12 prover kvar i

”Fylld” grupp och 11 exemplar kvar i ”deficient” grupp. För att ytterligare karakterisera

effekten av tiamin på simning uthållighet, var en mellangrupp som skapats strax före

experimentera. Sex slumpmässigt valda prover från den ”deficient” grupp injicerades med

tiamin 2-4 h före experimentet. Injektionen innehöll 15 umol T löst i steril

koksaltlösning, pH = 6,8, per prov. De gula ålar placerades enskilt i simbaskammaren,

som var 30,5 cm i diameter och 70 cm långa. En fullständig beskrivning av simbaskammaren

ges av Leonard et al . 63 . Vattentemperaturen hölls vid 18-20 ° C. varje prov

ades acklimatiseras till kammaren för 60 min med vattenflödet satt till 10 cm / s. Vattenflödet

ades sedan stegvis ökas med 10 cm / s var 20 min och tiden tills utmattning var

observeras. Den ”kritiska simma hastighet” interpolerades enligt principen som beskrivs av

Brett 64 . Gång utmattad, de gula ål avlägsnas från simning kammaren och dödade

med en överdos av MS-222, följt av cervikal dislokation. Varje prov vägdes till

närmaste 0,1 g, och den totala längden mättes till närmaste 1 mm. Lever och vita muskler

proverna omedelbart dissekerades, placerades i provbehållare, och lagrades vid -80 ° C tills

tiamin kvantifiering. I utvärderingen av effekten av vita muskler SUMT på kritisk simma hastighet,

både total längd och total vikt befanns obetydlig eftersom störande variabler, dvs den

materialet var homogen med avseende på dessa storleks variabler.

American blankål mognad experiment och provtagning. Mognaden experiment var

utfördes enligt det protokoll som presenteras av Oliveira & Hable 65 . Detta protokoll har varit

framgångsrika för produktion av fertilizable amerikanska ål ägg. Totalt 13 fältinsamlade silver

ål, som sträcker sig från 405 till 2169 g, hölls i 1000 L bassänger kopplade till en havsvatten (29-

31 ‰) genomflödessystem vid 20 ° C under experimentet. Bassängerna exponerades för omgivande

dagsljus från fönster och sålunda mottagna ca 10 h ljus och 14 h mörker per dag. De blankål

tilläts acklimatisera till laboratorieförhållanden under två veckor före början av

hormonbehandling. Eftersom ål antas inte att äta under migration 48 , var de inte matas

under acklimatisering eller mognad. Varje vecka var honorna lätt lugnande, vägs till

---

Sidan 12

12

närmaste 1 g och givna injektioner av 10 mg SPE i 0,5 ml salin per prov. när honorna

visade en kontinuerlig kropp massökning av> 5% per vecka, var oocyter samplas varje vecka genom

aspiration biopsi med användning av en 16-gauge nål införd i kroppshåligheten approximativt 5-8 cm

anterior av det urogenitala öppningen 66 . Oocyter ansågs närmar mognad när

mikroskopisk undersökning visade att de närmade sig 800 | im i diameter och uppfyllt flera

morfologiska kriterier som beskrivs av Oliveira & Hable 65 . Vid denna tid, en boosterinjektion på 10 mg

SPE gavs, och följande dag, var ägglossning induceras med en injektion av 2 mg DHP per

g kroppsmassa, 1,67 mg / ml i en saltlösning: etanol 1: 1 (volym: volym) blandning. DHP-injektioner gavs som en

serie av tre injektioner per sida av ål 3-4 cm från den ventrala mittlinjen och förmodligen

direkt i äggstockarna. Vid ägglossning, ades ägg uppsamlades för hand strippning direkt i plast

zip-lås påsar. Luftfickor pressades ut och påsarna förseglades. Äggen aldrig samplade

kom i kontakt med vatten. Lever dissekerades från det använda honorna och placeras i prov

behållare. Både ägg och levrar frystes omedelbart och lagrades vid -80 ° C fram till tiamin

kvantifiering.

Lax och havsöring. Vuxen atlantlax togs vid E1 på fiskeri

Research Station i Älvkarleby, Dalälven, under hösten 2006, och I9 vid Mörrums

Kronolaxfiske, Mörrumsån, på hösten 2011. På senare tillfälle, havsöring ägg var

samplas också. Atlantlax larver, som produceras av konstgjord befruktning, provtogs vid I9 vid

Mörrums Kronolaxfiske, Mörrumsån, och K1 på Statkrafts lax vattenbruksanläggning

i Laholm, Lagan, under våren 2012.

Provtagning av vuxen lax och havsöring. Vuxna lax och havsöring var

fångad under hösten i stationära ryssjor i respektive vattendrag. De hölls i stort

flöde-genom bassänger tills provtagning. Varje exemplar togs ur sin bassäng med en hand nät. På

I9, de levande exemplar (utan sedering) placerades upp och ner i en halvöppen stativ som är tillverkat av en

plaströr fyllt med vatten för att ta ett blodprov. Blodet togs från svans

ven med en hepariniserad (5000 IE / KY / ml) 2 ml spruta, vände lätt flera gånger för att förhindra att

blod från koagulering. Vid både E1 och I9 ades varje prov befriades från ägg eller mjölke för artificiell

befruktning. Provet sedan dödades med ett slag i huvudet och vägdes till närmaste

10 g. Totalvikten beräknades genom tillsats av vikten av de avskalade ägg eller mjölke. Total

längd uppmättes till närmaste 1 cm. Lever och återstående gonad (om någon) dissekerades. På

I9, var kvinnliga gonad vikt beräknas som summan av vikten av de avskalade ägg och den

vikt återstående gonad, medan den manliga gonad vikt inte in. Därför i

beräkning av somatiska index, antog vi den manliga gonad att utgöra 3% av den somatiska vikt,

ett värde stöd i litteraturen 67,68 . På I9, bitar av lever, epaxial vit muskler och hjärta spets,

liksom den högra halvan av hjärnan, provtogs för tiamin kvantifiering, medan vid E1, endast

ägg prov för tiamin kvantifiering. Proverna placeras i kryorör, nedsänkt i

flytande kväve, och lagrades vid -140 ° C fram till analys. För analys av tiamin beroende enzymer,

en central del av levern, liksom den vänstra halvan av hjärnan (I9) eller hela hjärnan (E1), var

framställd på samma sätt som för de kvinnliga europeiska blankålar. På E1, var levern prov

från de första 22 proverna, medan hjärnan togs från de återstående 8 proverna. På

I9, å andra sidan, lever och hjärna togs från alla prover. Den försiktighetsåtgärder för att lagra

prover för enzymatisk analys vid -140 ° C till specifikt motiveras av det faktum att den

termo av apoenzym har visat sig vara lägre än den holoenzymet

för TK i regnbågsforell ( Oncorhynchus mykiss ) 69 . Blodsocker, hemoglobin, och

---

Sid 13

13

hematokrit uppmättes på samma sätt som för de kvinnliga europeiska blankålar. provtagningen

av varje prov utfördes utan avbrott och avslutas innan nästa prov var

samplas. Efterföljande genetisk analys visade att en del av proverna vid I9 i själva verket

hybrider mellan lax och havsöring. Dessa prover uteslöts från

utvärdering av data. Havsöring på I9 har endast ägg tiamin kvantifiering prov.

Provtagning av atlantlax larver. Den atlantlax larver prov vid 166-175 dag-

grader (d ° C) (I9) eller 175-180 d ° C (K1) efter kläckning för att underlätta jämförelse med tidigare

undersökningar av atlantlax larver samplad vid 182 d ° C efter kläckning (E1) av Amcoff et al . 70 .

Vid I9, larverna härstammar från kända familj par som skapats från den mogna atlantlax

samplade tidigare och följaktligen förhållandet mellan tiamin status av den mogna

hona och hennes avkomma var möjligt att analysera. För varje familj par på I9 följande material

Prov togs från larver: 3-4 pooler av 3-4 hela larver vardera för tiamin kvantifiering; 4

pooler av 6 levrar vardera för analys av TK-aktivitet och latens; och en pool av 12 levrar för analys

av KGDH aktivitet och latens. Den individuella larver vägdes till närmaste 0,01 g och den totala

längden av de prover som ingick i urvalet för TK-analys mättes till närmaste 0,25 mm. poolerna

av hel larver placerades i kryorör, nedsänkt i flytande kväve, och lagrades vid -140 ° C tills

analys. Levrarna TK analys homogeniserades i 500 | il iskall 0,25 M sackaros i en

500 mikroliter Potter-Elvehjem-homogenisator (storlek 18) med åtta slag upp och ned vid 400 rpm och

under konstant kylning med isvatten. Homogenatet späddes ut med en annan 100 pl iskall

0,25 M sackaros, lägg i kryorör, nedsänkt i flytande kväve, och lagrades vid -140 ° C tills

analys av TK-aktivitet och latens, som mättes i homogenatet. De lever för KGDH

analys homogeniserades i 500 | il iskall 0,25 M sackaros i en 500 mikroliter Potter-Elvehjem

homogenisator (storlek 18) med åtta slag upp och ned vid 400 rpm och under konstant kylning med

isvatten. Homogenatet späddes ut med en annan 700 pl iskall 0,25 M sackaros, överfördes

till en 2 ml Eppendorf-rör och centrifugerades vid 10 tusen g AV- och 4 ° C under 10 min i en Eppendorf

5415R-centrifug (Eppendorf, Hamburg, Tyskland). Supernatanten avlägsnades och pelleten

i 2 ml Eppendorf-rör nedsänktes i flytande kväve, och lagrades vid -140 ° C till analys

av KGDH aktivitet och latens. Vid K1 rades larverna erhölls som en slumpmässig blandning av flera

okända familje par. Från detta material följande prover togs: 4 pooler av 3-4 helhet

larver vardera för tiamin kvantifiering och 6 pooler av 6 levrar vardera för analys av TK-aktivitet och

latens. Dessa prover bearbetades på samma sätt som för larverna från I9.

Analys av tiamin-brist-inducerad dödlighet i atlantlax larver. flera svenska

floder har utnyttjats för vattenkraftverk. Eftersom dammarna hindra lek

migration av atlantlax och havsöring måste vattenkraftverk etablera minst

en anläggning per utnyttjas floden för kompensations uppfödning av dessa arter för att stödja sina lager

i varje flod. (I Mörrumsån har det inte funnits någon föreläggande att utföra kompensations

avel, men detta skedde ändå under åren 1985-1997.) Avel har utförts i

familjeparen, i allmänhet genom att kombinera äggen av en hona med mjölke från en eller två hanar.

Sedan 1974, har tiamin-brist-inducerad mortalitet hos larverna redovisats på dessa

kompensationsuppfödningsanläggningar, även med luckor i tidsserien. Relationen mellan

tiaminbrist och mortalitet har baserats på typiska tiaminbrist symtom i

larver 71 . Antalet honor med tiamin-brist-inducerad mortalitet hos larverna, samt

som det totala antalet honor, har registrerats varje år i varje undersökt floden, och

motsvarande frekvenser av honor med larv dödlighet har beräknats. Dessa

---

Sidan 14

14

frekvenser för nio floder presenteras här, både för floderna separat och som ett genomsnitt av

en till nio floder. Eftersom vi har använt originaldata kan tidsserierna presenteras här skiljer sig

något från tidigare sammanställningar av frekvenser av honor med tiamin-brist-inducerad

dödlighet i larverna. Uppgifter om total längd och totalvikt vid E1, vilket mättes rutinmässigt

i samband med kompensations avel, användes för att jämföra den totala vikten och somatisk

tillstånd index (SCI, definieras nedan) mellan kvinnor med och utan larvdödlighet.

Vuxen sill. Vuxen strömming fångades på sina lekområden strax utanför Karlshamn (I8)

i länet av Blekinge vid tidpunkten för lek i mitten av april 2012. De 21 prover

fångas med kastspön med en jigg under tre dagar av intensiv fiske. I genomsnitt fyra spinning

stavar var aktiva under 3-4 timmar varje dag. I motsats till de flesta andra biologiskt material som ingår i detta

artikeln, sillmaterialet var troligen en icke-slumpmässigt urval från populationen. För det första

var ett urval av prover som var friska nog att migrera till sina häckningsområde vid kusten

för lek. För det andra, fångsten metoden var selektiv av mer aktiva prover med förmåga att

fånga en jigg. Efter fångst, proverna direkt sätta i ett akvarium med vatten från

uppsamlingsstället och transporteras till laboratoriet för provtagning inom några timmar.

Provtagning av vuxen sill. Den vuxna sill bedövades med ett slag på huvudet, och en blod

prov togs från kaudalvenen med en hepariniserad (5000 IE / KY / ml) 2 ml spruta, försiktigt

vände flera gånger för att hindra blodet från att levra. Lever och hjärna dissekerades för tiamin

kvantifiering och analys av tiamin-beroende enzymer. Eftersom hjärnan var så liten (0.14-

0,24 g), var det tilldelats antingen tiamin kvantifiering eller enzymatisk analys i ungefär lika

proportioner av exemplaren. Även vita muskeln dissekerades för tiamin kvantifiering. De

provtagning genomfördes på samma sätt som för de kvinnliga europeiska blankålar. Provtagningen av

varje prov utfördes utan avbrott och avslutas innan nästa prov var

samplas.

Kropps index för fisk. Den somatiska vikten definierades som den totala vikten minus gonad vikt.

Somatisk tillväxt (SG) definierades som den somatiska vikt (g) delat med ålder (år). Hjärta

somatisk index (HSI) definierades som den hjärtvikt uttryckt som procent av den somatiska vikt;

lever somatisk index (LSI) definierades som levervikten uttrycktes som procent av det somatiska

vikt; och gonadosomatic index (GSI) definierades som den gonad vikten uttrycktes som procent av

den somatiska vikt. Gonadototal index (GTI) definierades som den gonad vikten uttrycktes som procent

av den totala vikten. För atlantlax och sill, somatisk skick index (SCI) definierades som

100 gånger den somatiska vikt (g) divideras med den kubik totala längden (cm ^) 72 . För europeisk ål,

dock var den totala längden funnit olämpligt som en allometriska standard, eftersom det var

troligen minskat med tiaminbrist. Som alternativ använde vi hjärnan vikt, vilket har

visats vara relativt konstant i råttor 73 och möss 74 med och utan allvarlig tiamin

brist. Hence, för europeisk ål, var ett kroppstillstånd index (BCI) definieras som det somatiska

vikt (kg) delat med hjärnan vikt (g). Det fanns en god överensstämmelse mellan BCI och

SG i de europeiska blankål (Fig. S4j), som visar giltigheten av den nya BCI variabeln.

Tiamin kvantifiering. Icke-fosforylerat tiamin (T), tiamin monofosfat (TMP), och

tiamin difosfat (TDP) kvantifierades i det biologiska material med hög prestanda

vätskekromatografi (HPLC) med fluorescensdetektion (figurerna S7A. - d). analyserade matriser

ingår: blåmussla mjuk kropp och matsmältningskörtel; ejder lever, hjärna, och äggula;

---

Page 15

15

tamhöns lever och hjärna; Europeisk ål lever, hjärna, vit muskel, ägg och Elver

decapitated kroppen vila; Atlantisk lax lever, hjärna, hjärta spets, vit muskel, ägg och hela larver;

havsöring ägg; och sill lever, hjärna och vita muskler. Proven bereddes och analyserades

enligt Brown et al . 75 med modifieringar föreslagits av Kankaanpää et al . 76 och med

modifieringen att derivatisering reagens (nedan reagens), kaliumhexacyanoferrat, var

framställd i 150 mikroliter av 0,72 M NaOH till en koncentration av 0,05%. Metoden enligt Brown et al . 75

baserades på användning av 0,5 g prov och en reagenskoncentration nära vårt. Varje ny matris

var emellertid undersökas för adekvat mängd av prov och reagens, och vid behov även den

mängd av provet och / eller reagenskoncentrationen justerades (beskrivs nedan) för att optimera

tiamin kvantifiering. I derivatisering reaktion tiamin omvandlas till tiokrom. prover

filtrerades genom ett Chromacol 17-SF-45 (T) sprutfilter (Thermo Fisher Scientific Inc.,

Waltham, MA, USA). Tiamin kvantifierades med en LaChrom HPLC-system med följande

komponenter: Gränssnitt D-7000, Pump L-1000, Autosampler L-7200, kolonn Ugn L-7350, FL

Detektor L-7485, Solvent avgasare L-7612 (Merck, Hitachi, Tokyo, Japan). Analysen var

utförs med fluorescensdetektion (excitation λ = 375 nm, emission λ = 433 nm) och

kromatografiska betingelser enligt Mancinelli et al . 77 med undantag av att 85 mM, pH = 7,5,

kaliumfosfatbuffert: acetonitril 45:55 (volym: volym) användes som elueringsmedel under isokratiska betingelser.

Före blandning av de två vätskorna, var acetonitril avgasas i ett ultraljudsbad (JP Selecta

SA, Abrera, Spanien). De två vätskorna blandades i HPLC-pumpen efter lösningsmedelsavgasaren.

Varje körning var 25 min vid ett flöde av 1 ml / min. Den kromatografiska kolonnen var en Luna ® 5 um NH 2

kolonn 250x4,6 mm (00G-4378-E0) med dubbla skydds kolonner (väktare ™ NH 2

4x3.0 mm, AJ0-4302), alla från Phenomenex (Torrance, CA, USA). Guard kolumner samt

kromatografiska kolonnen var ofta ersättas för att upprätthålla god kromatografi. För

vissa matriser ( t.ex. blåmusslor), var det nödvändigt att byta ut skyddskolonner innan det

fanns några uppenbara tecken på försämrad kromatografi, för att rädda det kromatografiska

kolumn. Tiamin kvantifierades genom jämförelse med externa standarder. Retentionstiden

fönster jämfört med det yttre standard sattes till ± 0,06 min för T och TMP, medan

TDP topp var alltid entydig. Respektive toppar kontrollerades också visuellt. Nivån

av detektion (LOD) för metoden bestämdes genom upprepade injektioner av en standardlösning

en av T, TMP, och TDP i HPLC-systemet, såsom beskrivits av Boqué & Vander Heyden 78 . Detta var

görs med hjälp av två standardlösningar med respektive koncentrationer 80 nM och 200 nM innan

sanering, som gav mycket likartade resultat, och från vilken den genomsnittliga LOD beräknades. LOD

för T och TMP var ca 0,01 nmol / g i en 0,5 g prov och ca 0,03 nmol / g i en 0,2 g prov, medan

LOD för TDP var ca 0,03 nmol / g i en 0,5 g prov och ca 0,07 nmol / g i en 0,2 g prov. Att kolla

reproducerbarheten av metoden, erhölls en homogen referensmaterial framställt från sex

inhemska kycklinglever, som slogs samman, nedsänkt i flytande kväve, manuellt malts till

pulver i en mortel, och lagrades vid -140 ° C. Innan referensmaterial konsumerades en ny

referensmaterial framställdes från rådjur lever och interkalibrerade med föregående referens

material. Rådjur levern nedsänktes i flytande kväve och hamras i bitar, som var

maldes till pulver i omgångar med en CryoMill (Retsch GmbH, Haan, Tyskland) i en 50 ml-cell

innehållande fyra 10 mm rostfria stålkulor (3 min före kylning och 3 min slipning vid 25 Hz). De

satser av hjortar levern blandades sedan till homogenitet i flytande kväve i en mortel och lagrades vid

-140 ° C. Variationskoefficienter för analys av den inhemska kycklinglever referensmaterial

var 23,7% för T, 7,3% för TMP, och 13,6% för TDP, och variationskoefficienter för analys

av rådjur leverreferensmaterialet var 9,4% för T, 9,4% för TMP, och 14,8% för TDP. en

tamhöns äggula referensmaterial, som framställdes på samma sätt som den inhemska

---

Sida 16

16

kycklinglever referensmaterial, hade en variationskoefficient för T av 13% för analyser utförda

i 2005-2007 och 6,4% för analyser som utförs i 2013. SUMT definierades som T + TMP + TDP.

Modifieringar av tiamin kvantifiering. I början tiamin i blåmusslor från G1

kvantifierades antingen i enstaka prover eller i pooler av två eller tre exemplar. Det visade sig,

emellertid att de tiamin-koncentrationer som erhölls från prover som väger mer än 0,75 g var

systematiskt för lågt. När detta upptäcktes, var pooler av blåmusslor övergiven, och

hädanefter någon blåmussla mjuk kropp som väger mer än 0,75 g delades upp i mindre delar

analyseras separat, och resultatet rapporterades som ett vägt genomsnitt för det provet. lever

från alla arter analyserades som 0,2 g prover och med en reagenskoncentration av 0,2%.

Ejder äggula analyserades som 0,2 g prover tagna från en semi-tinade kryorör. I

För att undvika fel på grund av potentiella homogen inom ejder hjärnan, den högra halvan

av varje hjärna homogeniserades i 2% TCA och en alikvot motsvarande 0,5 g hjärnvävnad

tas ut för vidare beredning och analys. Av samma skäl, den högra halvan av varje inhemsk

kyckling hjärnan analyserades, och om ett prov vägde mer än 0,55 g, var det delas i två halvor

analyseras separat, och resultatet rapporterades som ett vägt genomsnitt för det provet. För

inhemska kyckling hjärnprover erhölls en reagenskoncentration av 0,2% användes. Atlantisk lax hjärta

spets och vit muskel analyserades som 0,2 g prover. Atlantic lax ägg analyserades som pooler

av tre ägg, varje pool som vägde 0,35-0,55 g. Duplicate ägg pooler analyserades för varje hona.

Atlantisk lax hela larver homogeniserades och analyserades såsom pooler som väger ca 0,5 g. De

Europeisk ål hjärnprover vägde 0,07-0,17 g och sillhjärnprover vägde 0.14-

0,24 g (dvs mindre än den vanliga provvikt på 0,5 g). Volymen av homogenisering mediet

halverades för europeisk ål hjärnprover, men inte för sillhjärnprover. För att

bibehålla möjligheten att göra tillförlitliga jämförelser med andra analyser med metoden Brown

et al . 75 , inga andra justeringar av metoden gjordes.

Normalisering av tiamin koncentrationer i lagrat material. För tre partier av blåmusslor

prov 2006, var hälften av varje sats analyserades i 2007, medan den andra hälften vid lagrades

-140 ° C och analyserades under 2013. I det material som hade lagrats djupfrysta i sex år, SUMT

var ca 32% lägre än motsvarande materialet analyseras i 2007. Sådan nedbrytning med

tid har observerats tidigare, åtminstone vid temperaturer mellan -20 ° C och -80 ° C 79 . I ordning

för att kompensera för nedbrytning av tiamin under lagring vid -140 ° C, den SUMT

koncentrationer av blåmusslor samplade 2006 och analyseras under 2013 multiplicerades med en faktor

av 1,46. Sådana blåmusslor utgjorde 65% av blåmusslor samplade 2006. Ingen nedbrytning

över T observerades i ejder äggula lagrades vid -140 ° C för samma tid. En förklaring

av skillnaden mellan blåmussla mjuk kropp och ejder äggula kan vara att tiamin

är mindre stabil i ett cellulärt matris än i ren äggula.

Normalisering av tiamin koncentrationer i blåmusslor. För att rädda en del av

tiamin analyser från pooler av två eller tre blåmusslor (som beskrivits ovan), var en standardkurva

konstruerad av mätningar i 41 prover av ett homogent referensmaterial av blå

musslor från G1. Provvikter var jämnt fördelade över intervallet 0,1-2,0 g. De

standardkurva avslöjade att TDP-koncentrationen minskade exponentiellt med provvikter

över 0,75 g. Detta förhållande tillät normalisering av TDP koncentrationer som uppmätts i

prover som väger mellan 0,75 och 1,25 g av formeln:

---

Sidan 17

17

C TDPnorm = C TDP * exp (1,5 * (vikt prov - 0,75))

(1)

Den konstanta 1,5 befanns empiriskt för att minimera skillnaden mellan den normaliserade TDP

värdena och de (korrekt) TDP värden erhållna från motsvarande blåmusslor analyserades vid prov

vikter lägre än 0,75 g.

Också T och TMP var systematiskt låg i prover som väger mer än 0,75 g. För dessa två

former av tiamin, var en empiriskt bestämd faktor som används för att normalisera värdena från den

formler:

C Tnorm = C T * 2,3

(2)

C TMPnorm = C TMP * 1,2

(3)

Normalisering med ovanstående formler utfördes i 17% av T-värdena, 9% av TMP

värden, och 18% av TDP värden från G1. Skillnaderna i andelen normaliserade T,

TMP och TDP-värdena var på grund av den ojämna antalet kromatografiska toppar som var

omöjligt att kvantifiera (beskrivs nedan). Dessutom blåmusslor med normaliserad tiamin

värdena var jämnt fördelade genom det undersökta materialet, dvs de inte var begränsade till

en viss provtagningstillfälle eller tid på året. Alla andra analyserade blå musslor prover vägde

mindre än 0,75 g.

Uppskattning av tiamin koncentrationer i blåmussla och tamhöns. TDP, som

allmänhet utgör ca 90% av den SUMT i blåmusslor (Fig. 2c, Fig. S2a), var det möjligt att

kvantifiera i alla prover utan problem (fig. S7B, c). För T och TMP dock

kvantifiering var ibland omöjligt, på grund av interfererande kromatografiska topparna (fig. S7c). I

sådana fall, var T och TMP-koncentrationer uppskattades för att erhålla en objektiv värde på

SUMT (inte för att studera T och TMP ensam). Uppskattningen formler baserades på de blå

musslor, där alla tre former av tiamin vore möjligt att kvantifiera. Saknade T-koncentrationer

uppskattades som 0,4% av TDP-koncentration, förutom vid G1, där en konstant T-koncentration

värde på 0,005 nmol / g användes i stället. Den logiska grunden för att använda en konstant i stället för en procentsats

vid G1 var att ingen procentsats skulle kunna bestämmas utifrån de kvantifierade T-värdena vid denna station,

medan medelvärdet av dessa värden var 0,005 nmol / g. Saknade TMP koncentrationer uppskattades

som 11% av TDP-koncentrationen i samtliga fall. Cirka 57% av T-koncentrationer och 7%

av TMP koncentrationerna i blåmusslor uppskattades på detta sätt. För tamhöns,

några T-koncentrationer uppskattades på samma sätt och för samma ändamål (för att erhålla en

opartisk värde SUMT, inte för att studera T ensam).

Normalisering tiamin koncentrationer i fiskägg. T-koncentrationen i fiskägg kan vara

analyseras före eller efter att äggen har tagit upp vatten (vatten-härdning) efter frisättning från

kvinna. I atlantlax, ökar ägg volymen typiskt med 25% under denna process 80 ,

som är avslutad inom några få timmar. När vi har analyserat SUMT i salmonine ägg dissekeras

eller strippas direkt från äggstocken, har vi justerat för den vattenhärdning genom att multiplicera

SUMT-koncentration med en faktor av 0,8. Eftersom vi inte vet motsvarande faktorn för anguillid

ägg var ägget tiamin koncentrationerna i amerikansk ål inte justerat för vattenhärdning.

---

Sidan 18

18

Uppskattning av tiamin koncentrationer i fiskägg. Inga Atlantic lax ägg prov på

K1. Därför var de ägg SUMT koncentrationerna vid denna station beräknas från SUMT

koncentrationer i larverna 175-180 d ° C efter kläckning, med hjälp av stark korrelation mellan SUMT

koncentrationer i nyligen befruktade ägg och larver 166-175 d ° C efter kläckning observeras vid I9 (se

Kompletterande Resultat).

Kvalitetsaspekter på tiamin kvantifiering. Flera metoder har tillämpats för att säkerställa en korrekt

kvantifiering av tiamin. Allt material samplas för tiamin kvantifiering lagrades vid -140 ° C i

För att minimera defosforylering och nedbrytning av tiamin. Av samma anledning som vi

hålls strikt till de riktningar och tidsgränser för den metod som beskrivs av Brown et al . 75 . Detta

metod valdes eftersom det är den mest använda metoden för kvantifiering av respektive

fosforylerade former av tiamin, och eftersom det har använts av oss tidigare. Det möjliggör sålunda

oss att göra tillförlitliga jämförelser med många andra analyser (inklusive våra egna tidigare data). De

tre former, T, TMP och TDP alltid analyseras separat, även i de fall där endast SUMT

användes i utvärderingen av data. Genom denna strategi, kunde vi följa respektive

proportionerna av de tre former, och, som en kvalitetskontroll, kontrollera att de var i det förväntade intervallet

för varje analyserad matris. Material med högre tiamin koncentrationer analyserades tillsammans med

material med lägre tiamin koncentrationer (vid samma tillfälle) för att säkerställa att den observerade

Skillnaderna var verkliga. I ett stort antal fall (ca 30 prover), där den kromatografiska

toppar av T och TMP doldes av interfererande kromatografiska topparna, var standard tillsats

appliceras för att korrekt identifiera de T- och TMP toppar i kromatogrammen (Fig. S7c). De

information som erhållits på detta sätt underlättat tolkning även av dessa kromatogram med

interfererande kromatografiska topparna, där standardtillsats inte tillämpats. kontroll~~POS=TRUNC experiment~~POS=HEADCOMP

bekräftade att kvantifiering genom standardtillsats och extern standard gav ekvivalenta resultat

(Fig. S7d). Med allt detta arbete på kvalitetskontroll, är vi övertygade om att vi har identifierat

tiamin toppar och kvantifierades de tiamin koncentrationer fullständigt.

Lever / hjärna SUMT förhållande. Våra undersökningar hittills 1 tyder på att förhållandet mellan lever SUMT

koncentration och hjärnan SUMT koncentrationen är användbar som en biomarkör för tiaminbrist i

ryggradsdjur. Den logiska grunden för denna biomarkör är att homeostas i hjärnan har högre prioritet än

homeostas i levern. Därför blir tiaminbrist uppenbar i levern innan det

blir uppenbar i hjärnan. Levern / hjärna SUMT förhållande har varit 2-3 i icke-tiamin-brist

ryggradsdjur prover, och så lågt som under en i tiamin-brist prover 81-83 . Vid allvarligare

tiaminbrist kan emellertid levern / hjärnan SUMT förhållandet börjar öka, eftersom levern SUMT

kan inte minska någon ytterligare, och därför förblir relativt konstant, medan hjärnan SUMT startar

att minska med ökande tiaminbrist. Detta exempel fallet i ejder

kvinnor i Blekinge län (region I) jämfört med de i Östra Island (område D) i

den aktuella undersökningen. Ett annat undantag från regeln var den icke-tiamin-brist sill i

denna undersökning, som hade anmärkningsvärt hög hjärn SUMT koncentrationer och, som ett resultat,

en lever / hjärna SUMT förhållande under ett, medan de andra analyserade biomarkörer indikerade inte tiamin

brist i dessa prover. Vi föreslår att levern / hjärna SUMT förhållandet är användbar som tiamin

brist biomarkör när tolkas med försiktighet.

Andra former av tiamin. Intracellulärt sker tiamin också i form av tiamin

trifosfat, adenosin tiamin difosfat och adenosin tiamin trifosfat. De

metabolism av dessa tiamin former har nyligen granskats av Bettendorff et al . 84 , och hittills

---

Sidan 19

19

deras fysiologiska roll är okänd. På grund av denna omständighet och det faktum att de i allmänhet

uppgå till mindre än 1% av den totala tiamin 84 under normala fysiologiska betingelser i vävnaderna

analyseras här har vi inte reserverat särskilda resurser för deras mätning i detta

undersökning.

Analys av tiamin-beroende enzymer. TDP är en kofaktor i tiamin beroende enzymer,

vilka är nödvändiga i den grundläggande metabolismen av varje levande cell. Om kofaktor saknas,

tiamin-beroende enzym är inaktivt. Tiaminbrist kan således resultera i en variation av toxiska

effekter på grund av reducerad enzymatisk aktivitet. Här mätte vi den endogena aktiviteten hos

två tiamin-beroende enzymer transketolase (TK) och α-ketoglutarat-dehydrogenas (KGDH).

TK-aktivitet mättes i matsmältningskörteln (blåmusslor) och levern och hjärnan

(Ryggradsdjur), medan KGDH aktivitet mättes endast i lever och hjärna. den endogena

aktivitet återspeglar mängden tiamin-beroende enzym med kofaktorn som ursprungligen fanns i

provexemplaret. Vi mätte även den maximala aktiviteten, som erhålles efter tillsats av överskott

TDP till provet. Om provet innehåller enzymet utan kofaktorn (apoenzym), den tillförda

extra kofaktor binder till apoenzymet och därigenom omvandlar den till en fullt aktivt holoenzym. Därav,

skillnaden mellan högsta och endogen aktivitet återspeglar den ursprungliga mängden enzym

där TDP saknades. Latens är denna skillnad uttryckt som procent av den maximala aktiviteten,

och har visat 85 sig vara ett bättre mått än TPP-verkan, om denna skillnad är

uttryckt som procent av den endogena aktiviteten. Teoretiskt är den maximala aktiviteten alltid

högre än eller lika med den endogena aktiviteten. En maximal aktivitet är något lägre än

endogen aktivitet kan förekomma, emellertid, utan är ett resultat av metod osäkerhet. För att undvika positiva

bias, var de resulterande negativa latenser användes i alla beräkningar och siffror, medan i tabellerna,

de trunkerade i redovisningen av det slutliga resultatet. Både endogen aktivitet och latens är

två viktiga biomarkörer för tiaminbrist. All verksamhet i tiamin beroende

enzymer som rapporteras här är endogena aktiviteter, om inte annat anges. TK-aktivitet var

mättes med en Hitachi U-3200 UV / VIS-spektrofotometer (Hitachi, Tokyo, Japan) eller en

Shimadzu UV-2600 UV-Vis spektrofotometer (Shimadzu Corporation, Kyoto, Japan) i

10.000 AV- supernatant. (För atlantlax larver emellertid TK i levern mättes i

homogenat.) Mätningen utfördes i 100 mM Tris-Cl-buffert, pH = 7,6, vid 30 ° C (blå

musslor och fisk) eller 25 mM Tris-Cl-buffert, pH = 7,0, 40-gradigt (fåglar), och i övrigt enligt

Tate & Nixon 86 . För mätning av maximal aktivitet, TDP tillsätts till kyvetten till en slutlig

koncentration av 100 | iM. Resultaten uttrycktes som nmol NADH förbrukas per min och mg

protein, som kvantifierades enligt Lowry et al . 87 med bovint serumalbumin som

standard. KGDH aktivitet mättes med en Shimadzu UV-2501PC UV-Vis spektrofotometer

(Shimadzu Corporation, Kyoto, Japan) eller en Shimadzu UV-2600 UV-Vis spektrofotometer

(Shimadzu Corporation, Kyoto, Japan) i re-suspenderades 10.000 AV- pellet. Mätningen var

utfördes vid 25 ° C (alla arter) enligt Lai & Cooper 88 och Lai et al . 89 . För mätning av

maximal aktivitet, till TDP till kuvetten till en slutlig koncentration av 200 | iM. Resultaten

uttrycktes som nmol NADH som bildas per minut och mg protein, som kvantifierades enligt

Lowry et al . 87 med bovint serumalbumin som standard. Alla mätningar utfördes

i duplikat rades enzymaktiviteterna visats vara linjär med tiden och mängden protein,

och lämpliga bakgrund och kontroll inkubationer utfördes rutinmässigt.

Analys av ethoxyresorufin- O -deethylase (EROD) aktivitet. EROD aktiviteten i 10000 AV

supernatanten mättes med en Jasco FP-777 Spectrofluorometer enligt metoden

---

Sidan 20

20

beskrivits av Prough et al . 90 . Resultaten uttrycktes som pmol resorufin bildat per min och mg

protein, som kvantifierades enligt Lowry et al . 87 med bovint serumalbumin som

standard. Mätningarna genomfördes i två exemplar, enzymaktiviteter var

visat sig vara linjär med tiden och mängden protein, och lämplig bakgrund och kontroll

inkuberingar utfördes rutinmässigt.

Histopatologi. Den ejder och tamhöns vävnadsprover för histopatologisk

analys dehydratiserades över natten, inbäddades i paraffin och skars i 4 jim sektioner som uppsamlats på

objektglas. Snitten färgades med hematoxylin och eosin (H & E) och Luxol snabb

blått, och undersöks i mikroskop. Mikroskopet bilden togs med en Nikon ECLIPSE 80i

mikroskop med en Nikon Digital Sight DS-FI1 videokamera kopplad till NIS-Elements D 4.13.03

bildanalysprogram (alla från Bergman Labora, Danderyd, Sverige).

Dataanalys. Statistisk analys gjordes med mjukvaran Statview 5.0 (SAS Institute Inc.,

Cary, NC, USA) och laddluftkylare Stata 12,2 (StataCorp LP, College Station, TX, USA), och

inkluderade variansanalys (ANOVA), regressionsmodeller, Wald test, Students t -test, den

Z-test, Pearson korrelation och Wilcoxon-Mann-Whitney-test. När en analys ingår

pooler av blåmusslor, var varje pool ges en vikt som motsvarar antalet av exemplar i

poolen. Shapiro-Wilk normalitet testet och Breusch-Pagan / Cook-Weisberg test för

heteroskedasticitet, såväl som diagnostiska tomter, användes för att förvissa sig om att antaganden om normalitet

och homoskedasticitet var uppfyllda. Endast 2-tailed test användes. P -värden under 0,05 var

vara signifikant. En stjärna (*) betecknar P <0,05, två stjärnor (**) betecknar P <0,01, och tre stjärnor

(***) betecknar P <0,001. Endast biologiska (ej tekniska) replikat användes här, dvs antalet

observationer motsvarar antalet analyserade prover.

I stapel och linjediagram, stängerna och markörer representerar aritmetiska medelvärden, och whiskers

representerar 95% konfidensintervall (CI). Även i texten, är värden ges som aritmetiskt medelvärde ± 95%

CI. I lådagrammen representerar lådan kvartilerna: Q1, Q2 och Q3. Två stängsel definieras som

Q1-1.5 × (Q3-Q1) och Q3 + 1,5 x (Q3-Q1). Whiskers är ritade som sträcker sig från ändarna av lådan

till de mest extrema värden som fortfarande inne i stängsel. Observationer som faller utanför stängslen

betraktas som möjliga extremvärden och anges med prickar 91 .

Demonstration av bivariata linjära förhållanden utfördes genom vanliga minsta kvadrat (OLS)

regression, på grund av sin mångsidighet och enkelt tolkningsbara P -värdet för lutningen och koefficienten

graden (R ^). När både y och x är föremål för fel, men OLS regression sluttningar är

mer eller mindre förspänd 92 . Problemet blir uppenbart som en mindre bra passform för regressionslinjen till

uppgifterna. I sådana fall, särskilt när vi var intresserade av intercept, vi utförde

geometriskt medelvärde (GM) regression som ett komplement till OLS regression. GM regression ger en

opartisk lutning och intercept när både y och x är föremål för fel 92 . Vid behov, 95% CI för

GM regressions fångar beräknades genom bootstrapping med 100.000 replika per

beräkning.

Eftersom blå musslan längdklasser (liten, medium, stor) ibland skilde sig i SUMT

koncentrering sattes längdklass med som en confounding variabel i blåmusslan SUMT

jämförelser mellan områden och provtagningstillfällen. Medel och 95% CI rapporterades som förväntat

värden för medel blåmusslor, dvs som om alla prover var av medellängd.

---

Sid 21

21

I diagrammen var färger som används på följande sätt: Östersjöområdet - röd; Atlanten -

blå; Great Lakes området - rosa; Stilla Havet - grå; och kontrollgrupper - grön. Orange och violett

användes för flera ändar.

---

Sida 22

22

kompletterande Resultat

Blåmussla ( Mytilus sp .)

Blåmusslor är utbredd inom norra halvklotet, och de är de viktigaste primära

konsumenten i Östersjön, där de utgör också viktigt byte för flera fåglar och fiskar,

t.ex. ett antal dykänder (inklusive ejder), plattfisk, europeisk ål 34,93 , och

den tånglake ( Zoarces viviparus ). Nyligen också mört ( Rutilus rutilus har) visats

att äta blåmusslor 94 . För några decennier sedan, blåmusslor var mycket vanliga på de hårda bottnarna av

Östersjön 95 och helt dominerade dess djur biomassa (90%) och produktion 96 . Deras

filtrering av organiska partiklar har erkänts som en viktig funktion av hela

ekosystem 97-99 . Kunskap är begränsad, men om tiamin produktionen i den primära mat

av de blåmusslor, dvs den fytoplankton 100 , och ytterligare forskning behövs för att belysa aktuella

relationer i vattenmiljön tiamin produktion.

Så vitt vi vet finns det ingen kvantitativ undersökning av densitet förändring av

Baltic Sea blåmussla befolkning under de senaste decennierna. I region G, emellertid miljö

övervakning av blåmusslan biomassa indikerade en nedgång på tre av sex undersökta stationer

1993-2010 101 . Dessa fynd överensstämmer med våra egna observationer att blåmusslor har

försvann mer eller mindre, från många platser i Östersjön och Island, där de tidigare

var mycket riklig. Blåmussla befolkningen minskar har också rapporterats på andra ställen i

på norra halvklotet, såsom den rumänska Svartahavskusten 102 , Vadehavet 103-105 , östra

England 106 , Connecticut kusten 107 , den amerikanska västkusten 108-110 och Japan 111 . andra nordliga

Hemisphere musslor med dödlighet som kan, åtminstone delvis, vara relaterade till tiaminbrist

inkluderar Chamelea gallina i Adriatiska havet 112 , olika arter i den holländska Vadehavet 103.113 ,

hjärtmussla ( hjärtmussla ) i östra England 106 , Island scallop ( chlamys islandica ) i

Island 114 , och långhals ( Balanus glandula ) 110 och ostron ( Crassostrea gigas ) 115 på US

västkusten. Blåmusslor och andra musslor har ett väl utvecklat immunförsvar 116.117 , vilket

kan undertryckas genom tiaminbrist. Därför kan infektion av olika patogener relateras

till tiaminbrist. Under de senaste decennierna har flera infektioner i musslor rapporterats i

olika delar av norra halvklotet, inklusive Pacific ostron vid den franska Medel

kust 118 och den franska västkusten 119 , Island pilgrimsmussla i skotska, färöiska och isländska vatten 120 ,

Japanska pilgrimsmussla ( Mizuhopecten yessoensis ) i Japan 121 och Akoya pärla ostron ( Pinctada fucata )

i Asien 6 . Det har kommit fram till att temperaturen och reproduktiv ansträngning ensam är otillräckliga för att

orsaka sommar dödlighet i Pacific ostron 122 . Ytterligare stressfaktorer, såsom t.ex. opportunistiska

patogener, är nödvändiga för att orsaka detta dödlighet 122 .

Mjuk kropp SUMT koncentration ibland skilde mellan längdklasser små, medelstora, och

stor (tabell S2a). När det fanns en skillnad, större prover hade lägre SUMT än mindre

prover. Detta fynd tyder på att tiaminbrist ökar med åldern. Mekanismen för

detta fenomen kan vara att äldre blåmusslor har varit föremål för flera episoder av tiamin

brist, vilket kan ha lett till mer eller mindre permanenta skador 123-126 . En annan möjlighet

är att storleken av filtrerade matpartiklar korreleras med storleken på blåmusslor, och att

livsmedel av mindre musslor innehåller således en större andel av bakterier och svampar, som kan innehålla

mer tiamin än växtplankton. För att underlätta jämförelsen mellan områden och provtagning

---

Sidan 23

23

tillfällen, har SUMT uppgifter normaliserades genom statistiska medel och presenteras som om alla blåmusslor

var av medellängd.

Tiaminbrist sjukdom kan bero på fel på tiamin fosforylering inom

cellerna. Sådant fel har observerats vara orsakad av genetiska faktorer 127 ,

metaboliska faktorer 128.129 , samt xenobiotiska föreningar 130,131 . Våra data dock föreslå normal

funktion av tiamin pyrophosphokinase 132 , eftersom proportionerna av T, TDP, och TMP var

mycket liknande i prover från Island och Östersjön, som skiljer sig i SUMT nivåer (fig. 2c,

Fig. S2a).

De blåmusslor i fig. S2b experimentellt utsattes för olika tider av hypoxi och

hypertermi, ett sätt att på konstgjord väg framkalla tiaminbrist i laboratoriet. den negativa

förhållandet mellan matsmältningskörtel TK-aktivitet och latens (Fig. S2b) verifierar, för första gången,

nyttan av dessa tiaminbrist biomarkörer även i blåmusslor. Det är anmärkningsvärt att

matsmältningskörteln TK-aktivitet verkar ha en allmän lägre gräns av 5-6 nmol / min / mg (fig. 2e,

Fig. S2b, c, e - g). Denna gräns kan vara en tröskel, under vilken långsiktig överlevnad är omöjligt. Det

Intressant är också att även de högsta matsmältningskörteln TK aktiviteter (Fig. S2E) var inom en faktor

endast 2,5-3,0 av denna tröskel. Således marginalen för överlevnad för de flesta

individer verkar vara liten i dag.

Ett negativt samband mellan matsmältningskörtel TK-aktivitet och latens observerades vid A4

(Fig. S2E) och i tre av fyra säsonger på G1 (fig. 2e). Ingen motsvarande relation observerades

vid B1 i vecka 42 (fig. S2F), C2 i vecka 41 (fig. S2G), eller G1 på sommaren (fig. 2e). Det är

anmärkningsvärt att den negativt samband mellan matsmältningskörtel TK-aktivitet och latens var

frånvarande endast när SUMT koncentrationer var bland de lägsta observerade i denna undersökning

(Fig. 2a, b; dessutom (ej visat), SUMT vid B1 vecka 42 var 1,0 ± 0,1 nmol / g), dvs när

tiaminbrist var särskilt svår. En del av en förklaring kan vara att personer med

högre TK aktiviteter saknas under sådana betingelser (Fig. S2h). Möjligen minskar TK latens

vid särskilt svår tiaminbrist, eftersom cellerna inte längre upprätthålla apoenzymer.

Detta skulle resultera i ett ökat antal personer med både låg TK aktivitet och låg TK

latens. Om så är fallet, kommer inte negativt samband mellan TK aktivitet och latens visas.

En indikation på vad TK aktivitet kan vara i en icke-tiamin-brist individ erhålls

från extrapolering till noll latens i GM regression i Fig. S2E, vilken illustrerar gruppen

med högsta tiamin status (A4 vecka 25) av dessa grupper där TK aktivitet och latens var

analyseras. Denna skärnings tar värdet 12,5 ± 1,3 nmol / min / mg och bör betraktas som en

minimum, eftersom en individ kan lida av tiaminbrist även vid noll latency om TK

latency är inte den mest känsliga av alla tiaminbrist biomarkörer. En indikation på vad

mjuk kropp SUMT koncentration kan vara i en icke-tiamin-deficient individ erhålls i

Fig. 2b, där det högsta medelvärdet var 3,4 nmol / g. Även detta värde bör nog ses

som ett minimum, eftersom SUMT värden upp till 7,6 nmol / g har observerats i enskilda blå

musslor. Extrapolering till noll latens i fig. 2d och fig. S2d gav en SUMT koncentration av 2,2-

2,4 nmol / g. Detta är lägre än 3,4 nmol / g, men fortfarande högre än de SUMT koncentrationer av de flesta

blåmusslor i dag. Extrapolering till en SUMT koncentration av 3,4 nmol / g i fig. S2c gav en TK

aktivitet av ca 12,9 ± 4,5 nmol / min / mg (ej visad), vilket överensstämmer väl med GM interceptet i

Fig. S2E.

---

Sidan 24

24

Fig. S2K illustrerar den starka positiva linjära förhållandet mellan torr kroppsvikt och våtvikt

baserat BCI för de två längdgrupper jämförs i fig. 2g. Följaktligen är våt vikt baserat BCI

ett giltigt alternativ till torrvikt, baserad tillståndsvariabler. En jämförelse av BCI nivåer mellan

de tre Östersjöområdet undersökta här gjordes i Fig. S2L. Mean BCI värden var i

variera 0.20-0.24 g / cm, och region F hade något lägre BCI än region G och I (Fig. S2L). Det är

anmärkningsvärda, dock att alla data i fig. S2L var från veckor 41-43 (den enda tids när data

fanns tillgängliga från alla tre regioner), vilket var inom en period av kraftig ökning av BCI, åtminstone

vid G1 (fig. S2m, övre pilen). Hence, den observerade lägre BCI i region F kan vara en temporal

snarare än en geografisk skillnad (fig. S2L). I vilket fall som helst, regionala skillnader i BCI inom

Östersjöområdet var små. Det är också anmärkningsvärt i Fig. S2m att den starka ökningen av BCI vecka

37-42 (övre pilen) följt på en stark ökning av SUMT vecka 32-37 (lägre pilen). Det kan

alltså hypotesen att tiamin status måste öka innan BCI kan öka.

Tabell S2b visar att BCI positivt var relaterad till mjuk kropp SUMT vid 9 av 18 stationer (50%)

eller på 11 av 44 provtagningstillfällen (25%). Dessutom, 9 av de 11 provtagningstillfällen med en

positiv linjärt förhållande (82%) inträffade under sep-Dec, trots en relativt

jämn fördelning av provtagningstillfällen mellan den första och den andra halvan av året. När

alla provtagningstillfällen poolades, det fanns en stark positiv linjärt samband ( P <0,0001)

mellan BCI och SUMT (tabell S2b). Självklart påverkar tiamin status BCI i blåmusslor,

och kanske mest uppenbart under hösten. Fig. S2n - q illustrerar två exempel med en positiv

förhållandet mellan BCI och SUMT (vecka 22 och 51) och två exempel utan detta förhållande

(Vecka 42 och 43). Det är anmärkningsvärt att förhållandet var frånvarande i den period då BCI var

ökar kraftigt. Det kan således hypotesen att förhållandet mellan BCI och SUMT är

skyms när dessa variabler kan komma att ändras, och skenbar när de är mer stabila.

En sådan variation kan förklara varför BCI kurvan var okorrelerad med SUMT kurvan i

Fig. S2m, även om de båda kurvorna var ungefär lika. BCI är antagligen påverkas av många

faktorer som kan skymma dess relation med SUMT. Möjligen den episodiska natur tiamin

brist bidrar till den observerade mönstret, där detta förhållande ibland är uppenbara och

ibland inte.

---

Sidan 25

25

Ejder ( Somateria mollissima )

En del av vår tidigare undersökning av tiaminbrist hos fåglar 1 fokuserade på reproduktionen av

den ejder genom analys av ägg och Pulli. Men för att hitta smittämnen, och dess

biokemisk mekanism, är det nödvändigt att analysera även äggläggningen honor. De

histopatologiska fynd på isländska och svenska vuxen hona gemensamma ejdrar var

överensstämmer med den normala bakgrunds patologi i denna art, och det fanns inga tecken på

allvarliga infektionssjukdomar. Detta är i enlighet med tidigare undersökningar av thiamine-

bristfällig atlantlax, där inget samband fanns mellan tiaminbrist och en

antal vanliga mikroorganismer 133 . I detta sammanhang bör det påpekas att

immunosuppression tiamin-brist individer gör dem mer mottagliga för olika

patogener än icke-tiamin-brist individer. Därför observation av ett fåtal herrelösa

patogener i analyserade prover ger inga bevis för att dessa speciella patogener är

primära orsaken till sjukdomen.

Eftersom ejder inte lämpar sig för ett liv på laboratoriet använde vi tamhöns

som ett surrogat kontroll. För att efterlikna fältet situationen, med antagna variation i tiamin status

av ejder honor den tiamin ”Complete” och ”brist” tamhöns grupper

i fig. 3a - f och fig. S3a, b var sammansatta av två dosgrupper vardera. Den tiamin ”komplett”

grupp kombinerade dosgrupperna 10 och 25 (medelvärde 17,5) nmol T per g torrt foder, medan den

tiamin ”deficient” grupp kombinerade dosgrupperna 0,9 och 1,5 (medelvärde 1,2) nmol T per g torrt

foder. Tabell S3a visar att en genomsnittlig Östersjön ejder, matar på blåmusslor,

erhåller en daglig SUMT intag jämförbar med den hos de lägre dosgrupperna (0,9-1,5 nmol per g torrt

foder) av tamhöns. Detta fynd tyder på att tiaminbrist i den gemensamma

eider är främst ett resultat av låg tiamin koncentration i sin huvud rov, blåmusslan.

Den låga dagliga SUMT intag av ejder stämmer väl överens med de dramatiska befolknings minskar

observerades för Östersjön gemensamma ejder under de senaste åren 134-136 (Fig. 3H). Dessa nedgångar kan inte

förklaras med faktorer av mer tillfällig karaktär, såsom giftig algblomning t.ex. 137 , vissa

predation t.ex. 138 , eller extrema väderförhållanden. Till förmån för tiaminbrist hypotesen är också det faktum

att befolkningen i andra dykning anka arter som livnär sig på blåmusslor i Östersjön har

minskade liksom 135 , även om de skiljer sig i stort sett i andra biologiska egenskaper. Till exempel,

ejder besöker Östersjön under sommaren halvåret, medan lång tailed

anka ( Clan hyemalis ) besöker Östersjön under vintern halvåret. Dessutom

ejder befolkningen har minskat även på Island under de senaste 15 åren, som bestäms av en

årlig undersökning av ejder bon i 17 kolonier, och nedgången var mer uttalad i vissa

av de undersökta områdena 139 . Denna utveckling har parallellt med en mer allmän population

sjunka i flera isländska sjöfågelarter 140-142 .

Dos-responskurvan för andelen lever TDP i tamhöns var klart bifasisk

(Fig. S3C). En minskning i dos från 10 till 1,5 nmol per g torrt foder resulterade i en ökning av

andel lever TDP, medan en ytterligare minskning av dos 1,5-0,3 nmol per g torrt foder

resulterade i en minskning i proportion lever TDP (fig. S3C). Denna senare delen av dos-respons

kurva (0,3-1,5 nmol per g torrt foder) var statistiskt signifikant genom linjär regression ( P = 0,0078).

Samma bifasiskt svarsmönster har observerats även i tiamin deficienta råttor 143 . De två

faser av dos-responskurvan för andelen lever TDP kan tolkas i det följande

---

Sidan 26

26

sätt. Vid måttlig tiaminbrist cellerna försöker behålla så mycket tiamin som möjligt TDP,

som är den form aktiv som en kofaktor i tiamin-beroende enzymer. Andelen TDP

ökar med tiaminbrist på bekostnad av proportionerna av TMP och T. Vid allvarligare

tiaminbrist, T och TMP kan inte minska någon ytterligare, och därefter den andel TDP börjar

att minska med ökande tiaminbrist. Vi föreslår detta bifasiska förhållande som en användbar

indikator på tiaminbrist.

I den inhemska kyckling dosgrupperna 1,5-10 nmol per g torrt foder, fanns det en negativ

förhållandet mellan andelen TDP och T-koncentration i levern (fig. S3d) och hjärna

(Fig. S3E), och samma förhållande observerades i de ejder honor (fig. S3F, g). en

motsvarande negativt samband mellan andelen TDP och T-koncentration har också varit

observerats i humant blod 144 . Tiaminbrist ades ytterligare av den negativa

förhållanden mellan aktivitet och latens för lever TK (Fig. S3h), lever KGDH (fig. S3i), och

hjärnan KGDH (fig. S3j) i de gemensamma ejder honor. Den negativa förhållandet mellan lever

KGDH aktivitet och latens skilde mellan Island och Sverige (Fig. S3i). Denna skillnad kan

vara ett resultat av olika historier av tiaminbrist mellan de två grupperna, såsom diskuteras nedan.

Fyra biomarkörer som mycket tydligt tiaminbrist i ejder honor

var KGDH aktivitet och latens i lever och hjärna (fig 3c. - f, fig S3i, j.). Sådana effekter på

KGDH har tidigare förknippats med en minskning även i sin maximala aktivitet 145-147 . Därav,

det är värt att notera att den maximala aktiviteten av detta enzym i levern var lägre i den gemensamma

ejder honor med minst en död avkommor (innan luckan) än i de utan döda avkommor

(Fig. S3K). Detta är ytterligare ett tecken på att tiamin status av den kvinnliga påverkar avel

resultatet, även i ett material där alla personer lider av svår tiaminbrist, och även

om avkomma dödligheten analyserades endast i äggen.

De inventeringar av gemensamma ejdrar vid I11 i Blekinge län under häckningssäsonger

2011-2013 avslöjade en konsekvent låg antalet överlevande Pulli. Det genomsnittliga antalet ägg i

en koppling var ca 4,0 (medelvärde av tre år), vilket var lägre än ca 4,6 rapporterats före

1970 148.149 . Stationen värd i genomsnitt ca 300 kvinnor varje år, och med enkel

multiplikation, bör det finnas ca 1.200 Pulli på vattnet strax efter lucka, men bara 5-10% av

detta antal observerades. Antalet kvinnor utan Pulli strax efter luckan var 5-10 gånger

antalet honor med Pulli.

Från ejder data tillgängliga här, är det svårt att uppskatta vad tiamin

koncentrationer och tiamin-beroende enzymaktiviteter bör vara i icke-tiamin-deficienta

individer. Den vanliga metoden att extrapolera till noll latens i relationer mellan latens och

annan tiaminbrist biomarkör kanske inte är tillämplig här, eftersom regressionslinjen

kan förspänd av tiaminbrist. Ett bra exempel på detta är de två olika lever KGDH

relationer i fig. S3i, en för Island och en för östersjöområdet. De ger extrapoleras

lever KGDH verksamhet 20,3 ± 5,0 och 28,3 ± 3,2 nmol / min / mg, respektive, vid fördröjningen noll. Det är

osannolikt dock att den verkliga KGDH aktiviteten i icke-tiamin-brist individer bör skilja

så mycket mellan de två länderna. Dessutom lever KGDH aktiviteten i tamhöns

komplett grupp var ännu högre, 40,1 ± 2,3 nmol / min / mg (fig. 3c). För ejder tiamin

koncentrationer, finns det inga korrelationer med latens tillgängliga i vårt material (diskuteras vidare

---

Page 27

27

Nedan). Vi vet bara att levern SUMT var ungefär en tredjedel av den i tamhöns komplett

gruppen (fig. 3a).

Lever EROD aktiviteten positivt relaterat till tiaminbrist i isländska gemensamma ejder

(Fig. S3L, m, Tabell S3b). Lever TDP, lever SUMT, lever / hjärna TDP-förhållande, lever / hjärna SUMT-förhållande,

endogen hjärn TK aktivitet och maximal hjärn TK aktivitet allt negativt relaterade till

EROD-aktivitet (tabell S3b). Andelen lever TMP var positivt relaterad till EROD-aktivitet,

medan andelen lever TDP var negativt relaterad till EROD-aktivitet (tabell S3b). Den senare

två observationer tyder på att isländska gemensamma ejder lider av en viss grad av tiamin

brist som motsvarar den vänstra delen av dos-responskurvan i Fig. S3C, där

andel TDP minskar med ökande tiaminbrist. Detta konstaterande är i själva verket kompatibel

med observationerna i fig. S3F, eftersom de flesta av isländska prover återfinns till vänster,

och den negativa förhållandet mellan andelen levern TDP och levern T koncentrationen är

beroende huvudsakligen på de svenska prover. Andelen lever TMP är huvud komplement

den andel levern TDP, och följaktligen, det linjära förhållandet mellan andelen lever

TMP och EROD-aktivitet har motsatt tecken mot det linjära förhållandet mellan andelen lever

TDP och EROD-aktivitet.

EROD-aktivitet, starkt förknippad med den CYP1A familjen cytokrom P450-enzymer 150-

152 , är en av de mest använda biomarkörer för exponering för klassiska långlivade organiska

föroreningar (POP), såsom polycykliska aromatiska kolväten (PAH), dioxiner och plana

polyklorerade bifenyler (PCB) 153,154 . Försiktighet bör användas, men när man studerar

individer nära deras reproduktion period, som i den aktuella undersökningen, på grund av väl

känt faktum att EROD-aktivitet ändras genom östrogen och andra östrogena substanser 155,156 . Fortfarande,

det positiva sambandet mellan EROD-aktivitet och tiaminbrist i isländsk gemensamma

ejdrar väcker den uppenbara frågan om klassiska POP kan vara ansvarig för tiaminbrist.

Svaret är förmodligen nej, eftersom ingen motsvarande förhållande observerades i

Svenska gemensamma ejdrar (tabell S3b), och eftersom exponeringen för klassiska POPs i miljön

varierar inte episod liknande förekomst av tiaminbrist ( t.ex. fig. S5t, u för Atlantic

lax presenteras nedan). Även negativa sambandet mellan EROD-aktivitet och LBI

(Fig. S3N) talar mot klassiska POP som orsaken till tiaminbrist. Om klassiska POP

var orsaken, ingen eller en positiv relation förväntas istället.

EROD induktion genom tiaminbrist har i själva verket föreslagits tidigare i Atlanten

lax 157 . Dessutom har laboratoriestudier visat att tiaminbrist ensamt kan orsaka

induktion av cytokrom P450 enzymer 158 . Grosse III & Wade 159 visade att laboratorieråttor ges

en tiamin fattig diet under tre veckor utvecklat både hög NADPH-cytokrom P450 reduktas

aktivitet, såväl som ökad mängd av cytokrom P450-enzymer i levern, mätt

enligt Omura & Sato 160 . Detta observerades trots minskade enzymatiska markörer för

hexosmonofosfatshunten. Ökad aktivitet av cytokrom P450-aktivitet

N-nitrosodimetylamin demetylas, såväl som en ökad mängd av isozymet CYP2E1,

observerades också när råttor matades tiamin fattiga dieter under tre veckor 161,162 .

Ytterligare cytokrom P450 aktiviteter induceras i samband med tiaminbrist analyseras

in vitro inkluderar oxidation av aminopyren, etylmorfin, och N-metylanilin, samt

hydroxylering av acetanilid och anilin 163.164 . Effekter av tiamin fattiga mat på enzymatisk

variabler kan resultera från tiaminbrist i sig , eller från reducerad utfodring grund av förlust

---

Page 28

28

av aptit, eller en kombination av de två 165.166 . Vidare har det visats att induktionen av P450

enzymer genom välkända inducerare, såsom fenobarbital och 3-metylkolantren, kan vara

starkare i tiamin-brist individer 166,167 . Förbättrad metabolism och utsöndring av

paracetamol observerades även in vivo i tiamin-deficient råttor 168 . Sammantaget dessa fynd

tyder på att rening av olika xenobiotika kan öka i tiamin-brist djur. Detta är

inte bara positivt, men eftersom biotransformeringen av xenobiotika är alltid förenat med en

risk för skador. Ökad rening av tiaminbrist bör också beaktas

undersökningar av biota inom området idag, speciellt när långtidsövervakning av xenobiotiska

nivåer i ett sådant biota show minskar tidstrender.

En självklar fråga är varför ett positivt samband mellan EROD-aktivitet och tiamin

brist observerades på Island men inte i Sverige (tabell S3b). Östersjöområdet är mer

förorenats av klassiska POP än Island 169.170 , och kanske sambandet mellan EROD-aktivitet

och tiaminbrist kan endast observeras när det är mindre interferens av andra EROD

inducerare. De svenska gemensamma ejdrar kan också vara för tiamin-brist för EROD-aktivitet

att svara normalt. En möjlig mekanism för detta kan vara sekundära infektioner och

inflammatoriska svar, som är kända för att minska cytokrom P450 aktiviteter, inklusive EROD

aktivitet 171.172 . Det har också visats i atlantlax som prover med svår tiamin

brist förlorar sin EROD-aktivitet 173.174 .

Fastän det är möjligt att EROD induktion kan orsakas av tiaminbrist, såsom indikeras

på isländska gemensamma ejder från en relativt förorenad område bör man komma ihåg att,

Hittills är det isoenzym som har visat sig öka med tiaminbrist CYP2E1 162 ,

som typiskt katalyserar demetylering av N-nitrosodimetylamine, men har inte förknippats

med EROD-aktivitet 150.175.176 . Så vitt vi vet mekanismen bakom detta CYP2E1

induktion från tiaminbrist är inte känd i detalj. Individuell cytokrom P450-enzymer

har distinkta men mer eller mindre bred substratspecificiteter, som i många fall överlappar med ett

en annan, och Kelley et al . 177 visade att en synergism mellan CYP2E1 och CYP1A2 kan inträffa

i rekonstituerade system med NADPH-cytokrom P450 reduktas. Förordning attribut

CYP2E1 och medlemmar av CYP1A familjen belyser komplexiteten i dessa enzymer.

En annan möjlig mekanism för EROD induktion genom tiaminbrist inhiberas thiamine-

beroende α-oxidation av vissa fettsyror 178.179 , varvid deras metabolism kan shuntas till

ω-hydroxylering i stället. Till exempel, inhiberade α-oxidation av den mycket giftiga phytanic syra 180-

182 , som är en nedbrytningsprodukt av klorofyll, kan resultera i ett akut behov av ω-hydroxylering

av denna molekyl för att underlätta dess efterföljande β-oxidation. Denna ω-hydroxylering utförs av

CYP4 familj av cytokrom P450-enzymer 183.184 . Återigen, dock har vi funnit någon information

i litteraturen om EROD aktiviteten hos CYP4 underfamilj medlemmar. En alternativ effekt av

tiaminbrist på EROD-aktivitet skulle kunna minskas kroppen lipid reserver, såsom beskrivs nedan

för den europeiska och amerikanska ål, och frisättning av klassiska lipofila EROD inducerare när

kropps lipider konsumeras.

De data som presenteras här visar svår tiaminbrist i ejder honor i både

Island och i Sverige. När det fanns en skillnad mellan dessa länder tiamin

brist var mestadels mer allvarlig i Sverige (fig 3b, d. - . f, fig S3i, j, Tabell S3C). Den lägre

lever / hjärna TDP och SUMT-förhållanden på Island än i Blekinge (tabell S3C) berodde på högre hjärn

---

Page 29

29

TDP och SUMT nivåer (Students t -test P <0,001, icke visat) på Island än i Blekinge, medan

lever TDP och SUMT nivåerna var desamma i de två länderna (tabell S3C). denna observation

tyder på att levern tiamin har nått en nedre gräns i både Blekinge och Island, medan hjärnan

tiamin fortfarande kan återspegla skillnader i tiamin status. Det är anmärkningsvärt att levern / hjärnan SUMT

förhållandet var mindre än en i båda länderna, som i sig är en stark indikation på allvarlig tiamin

brist. Den högre LBI i Sverige än på Island (tabell S3C) kan också vara på grund av allvarligare

tiaminbrist i Sverige. Experiment, i vilka råttor matades en tiamin-fattig diet, har

visat att LBI minskar i tiamin-deficienta gruppen jämfört med kontrollen när de ges ad

libitum 73.185 , medan LBI ökningar i tiamin fattiga gruppen jämfört med ett par-fed

kontroll 73.186 . Onormal ökning av leverstorlek har också observerats hos människa vid avancerade stadier

av tiaminbrist 187 . Det kan således hypotesen att LBI minskar vid mer moderat

tiaminbrist, främst på grund av minskad utfodring grund av aptitförlust, medan vid mer

svår tiaminbrist börjar LBI att öka. Detta skulle vara i linje med både den observerade

negativt samband mellan LBI och EROD-aktivitet på Island (fig. S3N) och den högre LBI i

Sverige än i Island (tabell S3C). Upptäckten av allvarligare tiaminbrist på svenska

än i isländska gemensamma ejder överensstämmer med vår tidigare undersökning av tiaminbrist i

fåglar 1 , där vi observerade svår tiaminbrist i Östersjöområdet och begynnande tiamin

brist på Island. Den allvarligare tiaminbrist i Sverige än på Island lägger också

Ett annat argument mot klassiska POP som orsaken till tiaminbrist. Om klassiska POP

var orsaken, skulle vi förvänta oss att hitta högre EROD-aktivitet i Sverige än på Island, men vi

observerade den motsatta, om än skillnaden var liten (tabell S3C).

Uppgifterna om isländska och svenska gemensamma ejder som presenteras här tyder på att deras tiamin status

har bara en liten marginal till tröskeln för att överleva. Det bör också komma ihåg att

biomarkörer svar beror både på tidigare tiaminbrist, vilket kan ha inträffat

episod under många år, och på aktuell tiaminbrist, vilket beror på

tillgången på tiamin vid tidpunkten nära innan provtagningen. Past tiaminbrist kan uppstå

i kombination med föreliggande tiamin brist eller tillräcklighet, och på motsvarande sätt, förbi tiamin

sufficiency kan förekomma i kombination med föreliggande tiamin brist eller tillräcklighet. Sådan

skillnader i historien om tiaminbrist mellan isländska och svenska gemensamt

ejdrar kan delvis skymma biomarkörer svar. Med detta i åtanke, tiaminbrist

biomarkör svarsmönster ännu anmärkningsvärt tydlig.

Histopatologi av levern, myokardiet, njure, pankreas, tarm, lunga, äggstock, lårmuskel,

och perifera nerver och ganglia undersöktes i 12 isländsk och i tio av de 23 svenska

vuxna kvinnliga gemensamma ejder. I de flesta av prover från båda områdena, mild periportal och

perivaskulär blandad cellinfiltration fanns närvarande i levern. Blandad cellinfiltration i njurarna

observerades i fyra isländska och tre svenska prover, troligen indikerar coccidia

angrepp. Fyra isländska och två svenska prover hade en mild inflammatorisk reaktion i

bukspottkörteln. Intestinala nematoder observerades i tre isländsk och en baltiska prov (er). Nej

tecken på inflammation, infektion eller parasitangrepp observerades i andra organ, och det

fanns inga degenerativa eller andra förändringar i de perifera nerver eller ganglia. dessa histopatologisk

fynd överensstämde med den normala bakgrunds patologi i ejder och

Graden av denna bakgrund patologi skilde sig inte mellan Island och Sverige.

---

Page 30

30

Det finns mycket få vetenskapliga publikationer beskriver histopatologi av tiaminbrist i

fåglar. I en artikel från 1940, duvor med experimentellt framkallad tiaminbrist var

rapporterats uppvisa perifer nervdegeneration, chromatolysis av neuronala cellkroppar i dorsala

rotganglier och degeneration av ryggmärgen vit substans 188 . Några av de duvor visade också

fokal nekros och inflammation i hjärtat 188 . I en artikel från 1972, tamhöns, matas en

tiamin fattig diet utvecklade allvarliga neurologiska tecken 189 . Det fanns dock ingen

histopatologiska lesioner i det centrala eller perifera nervsystemet 189 . I en artikel från 2002,

tiamin-brist honeyeaters, upprätthålls i en australisk viltreservat, visas neuropil

vakuolisering, blödning, och neuronal nekros i hjärnstammen 190 . Majoriteten av

honeyeaters hittades döda utan föregående kliniska symptom, och histopatologisk hjärna

lesioner var närvarande i endast tredjedel av proverna 190 . De observerade skillnaderna i

histopatologisk manifestation mellan dessa tre fall kan vara relaterade till arter eller graden

och / eller varaktigheten av tiaminbrist.

På grund av bristen på tidigare histopatologiska undersökningar av tiamin-brist fåglar,

Vi producerade nio tiamin-brist inhemska kycklingar i ett experiment, där hjärna, lever,

hjärtmuskeln, njure och vadmuskeln togs prover för histopatologisk analys. Fem av dessa

prover visas minimal till måttlig neuropil vakuolisering i de cerebellära djupa kärnorna,

medan inga andra delar av hjärnan påverkades. Vakuolerna varierade i storlek från små bubblor

till stora, tomma utrymmen av samma storlek som en neuronal cellkropp (fig. S3o). Ett prov visade

liknande neuropil vakuolisering i lateral geniculate kroppen av hjärnstammen, men inte i andra delar

av hjärnan, såsom hjärnbarken, lillhjärnan cortex eller hippocampus. Det fanns ingen

blödning i något av hjärnan, och ingen demyelinisering. Två prover visade fokal nekros

och inflammations i myokardiet, och liknande ändringar var också närvarande i vadmuskeln

i en av dessa, såväl som i tredjedel prov. Den neuropil vakuolisering observerats i lillhjärnan

djupa kärnor och hjärnstammen av dessa inhemska kycklingar liknade en del av den histopatologiska

fynd i tiamin-brist honeyeaters 190 . Precis som i honeyeaters, histopatologisk

förändringar i hjärnan var frånvarande i några av de inhemska kycklingar. Denna upptäckt förväntades

och föreslår att histopatologiska förändringar är sekundärt till subcellulära förändringar på grund av

tiaminbrist, eftersom subcellulära förändringar var närvarande i alla tiamin-brist inhemska

höns och i en stor majoritet av de gemensamma ejdrar. De observerade förändringarna i den inhemska

kyckling hjärnor var i överensstämmelse med dem som beskrivs i andra tiamin-defekta djur ( t.ex. katter

och rävar). Typiskt är neuropilen vakuolisering, blödning, och / eller neuronal nekros observer

i den laterala kroppen geniculate och andra periventrikulära kärnorna i hjärnstammen 191 . Även om

hjärnor 12 isländska och de tio svenska vuxen hona gemensamma ejdrar var inte tillgängliga för

histopatologisk analys hade vi tillgång till hjärnan av en annan vuxen ejder från region

I. Detta prov visade kliniska symptom på tiaminbrist och onormalt beteende,

som att gå runt planlöst på en inre highway (fel habitat) orädd för människor, men

utan yttre eller inre skador. Kemisk analys av detta prov visade också en lever SUMT

koncentration av 3,7 nmol / g och en hjärna SUMT koncentration av 5,9 nmol / g, som är i huvudsak

lägre jämfört med de flesta andra vanliga ejder undersökts här. Hjärnan av denna extra

ejder visas minimal neuropil vakuolisering, som kan motsvara den

histopatologiska fynd i tiamin-brist inhemska kycklingar. I detta sammanhang bör

också nämnas att vi har observerat dussintals vanliga ejdrar i inlandet i denna region, det vill säga

fel livsmiljö.

---

Page 31

31

Lillhjärnan djupa kärnorna (särskilt påverkas i den inhemska kycklingar) är med få undantag i

enda källor ut från lillhjärnan, och deras prognoser är utbredda i hela

hjärnstammen 192 . Följaktligen kommer skada på detta område resultera i störd reglering av muskeltonus,

samordning av rörelser och underhåll av balans. Det är därför mycket intressant att den kliniska

symptom på den inhemska kycklingar ingår bl.a. förlust av styrka i benen och obalans. De

lätt föll ner på ena sidan, eller bakåt, och kunde inte få upp igen. De visade också

matthet, ville och bara ligga under kylaren (artificiell mor). Alla dessa symptom var

överensstämmande med cerebellär dysfunktion. Jämfört med många andra djur, fåglar har mer

sofistikerade cerebellär och vestibulära system, eftersom de måste ta itu med komplexa rörelser

i tre dimensioner 193 . De beteende manifestationer av lesioner i de cerebellära djupa kärnorna får

alltså vara mer kritisk för fåglar än många andra djur. Det har också visat sig att lillhjärnan

störningar tenderar att påverka de dominerande typerna av rörelse hos djur, dvs hos fåglar som flyger mycket,

kliniska symptom hänför sig huvudsakligen till flygning, fåglar som simmar är simning försämras, och

gående djur är gångart påverkas 194 . Möjligen kommer tiamin-brist fåglar presterar sämre,

när de måste klara hårda vindar och undvika fysiska hinder ( t.ex. vindkraftverk).

Förändrad beteende kan manifesteras också på andra sätt. Det är väl känt att gemensamma ejder

förse sina bon med mycket ner. Därför är det anmärkningsvärt att en normal mängd boet ner

observerades endast i 67% av de bon på Island och 52% av bon i Sverige, medan resten

av bon innehöll mindre eller mycket mindre ned än normalt, enligt vår klassificering.

Dessutom under de lager av gemensamma ejdrar vid I11 (beskriven ovan), fann vi att 2-

15% av bon av flera fågelarter, inklusive den ejder, den vitkindad gås ( Branta

leucopsis ), gråtrut ( Larus argentatus ), gräsand ( Anasplatyrhynchos ), Kanada

gås ( B. canadensis ), och knölsvan ( Cygnus olor ), innehöll ägg av andra arter 195 . Många

bon innehöll även udda föremål, såsom stenar och bitar av plastavfall, som fåglarna tydligen

hade ingår i kopplingen 195 . Under varulager, observerade vi också Pulli med onormal

beteende, till exempel när attackerad av en mås, de varken dök heller sprang iväg, och var därmed en enkel

byte att fånga 196 . Den observerade onormalt beteende indikerade allvarlig neurologisk störning,

vilket är väl i linje med kända effekter av tiaminbrist som beskrivs i litteraturen, såväl

som den faktiska tiaminbrist demonstreras i honorna (denna undersökning) och Pulli 1 .

---

Page 32

32

Anguillid ål ( Anguilla spp .)

Minst tre medlemmar av den globala släktet Anguilla 197 har minskat dramatiskt sedan 1970-talet:

den japanska ålen ( A. japonica ), europeisk ål, och den amerikanska ål 198 . För närvarande finns det inget

vetenskapligt bevisade och accepterad förklaring av dessa avböjer 199 , även om migrations hinder

kontinentala vatten och blankål dödlighet under passage genom vattenkraftverk turbiner 200 ,

förändringar i havscirkulationsmönster 201,202 , överfiske 202 och dioxinlika föroreningarna 203 har varit

föreslagits som bidragande faktorer. De flesta av dessa faktorer har dock varit möjligt att

utesluta som allmänna eller största bidragsgivarna till de observerade nedgångar på anguillid ål 204 . Numret

av europeisk ål leptocephali återvänder från Sargassohavet har minskat med 90-99% sedan

1980 198 , och arten klassificeras för närvarande som ”akut hotad” i ”The IUCN röda lista

av hotade arter ™”. På grund av sin storlek, måste denna nedgång anses vara ett hot mot

den genetiska mångfalden av arten. Den brantaste nedgången i den europeiska ålbeståndet inträffade

Under den första halvan av 1980-talet 198 , och det är intressant att det fanns en stor variation mellan

år i överflödet av glasål och gula ål i svenska vatten under denna tid och

föregående årtionde 205 , ett mönster som överensstämmer med episodiskt förekommande tiaminbrist. Det är också

intressant att nedgången i de europeiska och amerikanska ål populationer har sammanfallande

med uppkomsten av A. crassus vid respektive kontinenter. Det nära förhållandet mellan den

Europeiska och amerikanska ål gör det intressant att jämföra deras tiamin status på respektive

sidor av Atlanten. Den japanska ålen har nyligen föreslagits att leka i nord

västra Stilla havet, väster om Marianerna 206,207 , vilket innebär att även denna art vandrar

en lång väg för lek.

Även om tiamin status förbättrades i glasål från floden Severn (L1) som badade

två gånger i en 100 mg / LT, lösning 48 h varje gång (fig 4b. - . e, fig S4b, c), denna behandling var inte

tillräckligt för att helt eliminera tiaminbrist. Området av lever TK latenser minskade

0-31% till 1-16%, men inte mer (fig. S4b, c). Dosen dock låg jämfört med

liknande bad behandlingar av Atlantic salmon yngel, där T doser upp till 2000 mg / L användes för att

uppnå fullständig eliminering av tiaminbrist 70.208 . Även i dessa Atlantic lax yngel, en

T dos av 100 mg / L resulterade i endast partiell förbättring av tiamin status 208.209 . Det borde vara

påpekade att upptag av tiamin från vattnet är en onaturlig upptag rutt, som är

obetydlig inom området, eftersom naturliga vatten har mycket låga tiamin koncentrationer, både i

marina 210-213 och limniska 214-217 miljöer. Detta förklarar också varför så höga bad T doser

krävs för att få full effekt. Den tiaminbrist observeras i glasål (Fig 4b. - e,

Fig. S4b, c) sannolikt mindre beroende av sin tidigare äggula tiamin innehåll, eftersom

anguillid ål ägg är endast ca 1 mm i diameter, och det antas att äggulan förbrukas

inom några dagar upp till några veckor efter lucka i Sargassohavet. Detta antagande stöds av

observationer av fångenskap japanska ål, där äggulan konsumerades i åtta dagar 218 . Den här gången

skall jämföras med den tid det tar för leptocephali att nå kusten (åtminstone 7-9

månader och upp till tre år). Den tiamin status leptocephali är därför sannolikt att vara mer

beroende på innehållet tiamin i kosten, den marina snön 32 . För låg tiamin koncentration

i ål ägg kan dock orsaka dödlighet eller irreversibel skada på ål larver redan

Sargassohavet. Det är anmärkningsvärt att det inte fanns några muskel TDP koncentrationer under 2,7 nmol / g

i glasålar (Fig. S4C). Detta värde kan utgöra en tröskel för att överleva på denna utvecklings

skede.

---

Page 33

33

Det positiva sambandet mellan lever TK aktivitet och SUMT i den europeiska blankål vid I9

skilde mellan 2012 och 2013, även om intervallen SUMT koncentrationerna var nästan

identiska (fig. S4D). Denna skillnad kan vara ett resultat av olika typer av ål fällor, och sålunda

olika historier av tiaminbrist (såsom diskuterats ovan för den ejder), mellan

två grupper. De blankål samplade under 2012 hade lägre TK aktivitet och kan således ha varit föremål

till allvarligare tidigare tiaminbrist.

Det fanns inget negativt samband mellan KGDH aktivitet och latens i levern eller hjärnan i

Europeiska blankålar (ej visade). För KGDH i levern, var aktiviteten 30,9 ± 2,1 nmol / min / mg

(Intervall 22,4-40,0 nmol / min / mg, n = 24) och latensen var 1,1 ± 1,2% (intervall 0-5,3%, n = 24). För

KGDH i hjärnan, aktiviteten var 10,3 ± 0,8 nmol / min / mg (intervall 7,6-14,4 nmol / min / mg, n = 24)

och latensen var 3,9 ± 2,1% (intervall 0-12,3%, n = 24).

Förhållandet mellan andelen levern TDP och levern T-koncentrationen i den europeiska

blankål var bimodal (fig. S4g). De två lägen speglar förmodligen de två faserna av dos-

respons-kurvan i Fig. S3C. Den högra läget motsvarar den högra fas, där

andel lever TDP ökar med ökande tiaminbrist, medan den vänstra läget

motsvarar den vänstra fasen, där andelen TDP minskar med ökande tiamin

brist. Det faktum att de flesta blankål i fig. S4g hade mycket låga koncentrationer av lever T

indikerade svår tiaminbrist i dessa prover och kan förklara den negativa förhållandet

mellan antalet A. crassus i simma blåsan och andelen lever TDP (fig. 4k).

I de europeiska blankålar, var SG positivt relaterade till levern SUMT (fig. 4 g) och

lever / hjärna SUMT-förhållande (fig. S4i). Det fanns också ett positivt samband mellan hjärnan TK

aktivitet och BCI (Fig. 4h). Dessa fynd tyder på en negativ effekt på tiaminbrist på

utfodring och tillväxt, ett fenomen som har visats tidigare i anguillid ål i den

laboratorium 219.220 . Giltigheten av variablerna SG och BCI visades genom deras nära positiva

förhållande (fig. S4j).

Levern SUMT (fig. S4K), lever / hjärna SUMT-förhållande (fig. S4L), och lever / hjärna TMP-förhållande (fig. S4M)

alla minskade med ökande ålder. Dessa fynd tyder på att tiaminbrist ökar

med åldern. Mekanismen för detta fenomen kan vara att äldre blankål har varit föremål för

fler episoder av tiaminbrist, vilket kan ha resulterat i mer eller mindre permanent

skada 123-126 . Det fanns dock ingen motsvarande negativt samband mellan vit muskel

SUMT och ålder (fig. S4K). Detta konstaterande kan förklaras av det faktum att den vita muskeln SUMT

intervallet var från 1,0 till 2,7 nmol / g, vilket är en låg nivå, kanske en tröskel för överlevnad.

Den hematokrit har visat sig minska i samband med tiaminbrist i

Europeisk ål 221 . Därför är de positiva relationer mellan hematokrit och TK aktivitet i levern

(Fig. S4N) och hjärna (fig. S4o), såväl som den negativa förhållandet mellan hematokrit och hjärna

TK latens (Fig. S4P), alla passar in i bilden av tiaminbrist i de europeiska blankålar.

Eftersom både hematokrit och antalet A. crassus i simma blåsan (fig. 4k) var relaterad

till tiaminbrist, analyserade vi om dessa två variabler var relaterade till varandra. där

var emellertid inget sådant samband i denna undersökning, en iakttagelse som överensstämmer med de flesta

befintlig litteratur 222-225 , dock med vissa undantag 226 . Det är därför troligt att variationen

---

Page 34

34

i hematokrit och antalet A. crassus i denna undersökning var i själva verket kopplad till

olika grad av tiaminbrist.

Precis som i andra organismer, latensen av tiamin beroende enzymer i icke-tiamin-brist

ål bör vara noll eller nära noll. Detta har bekräftats för njurarna hos icke-thiamine-

bristfällig europeisk ål, där den genomsnittliga TK latensen visade sig vara högst 2-6% 221.227 . De

Majoriteten av de europeiska silver ål i denna undersökning hade högre lever TK latenser, med

ett maximum av 15% (fig. 4f), samt högre hjärn TK latenser, med ett maximum av 24%

(Fig. S4P). Dessa observationer lägga till bevis på tiaminbrist i den europeiska silver

ål.

Eftersom lek kvinnliga blankålar i Sargassohavet inte var tillgängliga för analys 44 massan

balans av SUMT i sådana individer modellerades för två scenarier, vilka är tillgängliga som

xlsx fil i ytterligare information. Genom denna modell kan vi uppskatta graden av tiamin

brist, liksom rimliga värden för icke-tiamin-brist blankålar. Modellen jämfört

den tiamin status i början av övergången till Sargassohavet och strax före lek

(Frisättning av ägg). Det var enkla och inte ta hänsyn till förlust av tiamin genom metabolism

och / eller utsöndring. Inte heller det står för förlust av kroppsmassa på grund av energiomsättningen under

migrering. Värden som anges i modellen (gula celler i xlsx fil) erhölls från vår egen

analyser, såväl som från litteraturen.

Modellen antas en hona som vägde 1 kg i början av migreringen. I detta skede

gonad har börjat växa, men inga synliga ägg har utvecklats. Den genomsnittliga GTI i den europeiska

blankålar var 1,4%, som användes i modellen. Den totala kroppsvikten (TBW) ändringsfaktorn

antogs vara 1,30, baserat på utredning av Oliveira & Hable 65 . Det bör nämnas att

viktökning orsakas främst av upptag av vatten, eftersom blankål inte äter under sin

migration till Sargassohavet. GTI strax före lek antogs vara 50%, baserat på

undersökningen genom Palstra et al . 66 . Detta innebär att gonad växer inte bara av vattenupptag,

men också på bekostnad av den somatiska kroppen, vilket krymper. I modellen, var den somatiska kroppen

uppdelad i en konstant somatisk kroppsdel (CSBP), som består av ben, skalle, ögon, hjärna, och

skalor, som inte krymper under mognad och kroppen resten (BR), som består av hud, gälar,

simblåsa, mage, tarm, hjärta, blod, njure, mjälte, och fett, som krymper genom

omvandling till ägg. För enkelhetens skull har BR antas krympa jämnt. CSBP var

antas utgöra 25% av den ursprungliga somatiska vikt, baserat på undersökningen genom Balk et

al. 228 . Den genomsnittliga LSI i de europeiska blankål var 1,1%, som användes i modellen. Den vita

muskel somatisk index (WMSI) och röd muskel somatisk index (RMSI) antogs vara 41%

och 7%, respektive, baserat på undersökningen genom Egginton 229 .

För att få information om könsmognad, var äggproduktion induceras av gonadotropin

behandling av kvinnlig amerikansk blankålar fångas i Paskamansett River (N1) och St Lawrence

River (O1) och fördes till laboratoriet. Vid mognad, deras ägg hade en genomsnittlig SUMT

koncentration av 2,7 nmol / g (intervall 1,7-4,8, n = 13), som användes i ”Scenario 1 Genomsnittlig dag”.

Samma SUMT koncentration antogs för gonad i början av migration. I

Europeiska blankålar, dvs i början av migreringen medel lever SUMT koncentrationen

11 nmol / g (intervall 5,7-17, n = 38), medan den genomsnittliga lever SUMT-koncentrationen i den mogna

gonadotropin-behandlade amerikanska blankål var 6,1 nmol / g (intervall 4,9-9,6, n = 12). båda dessa

---

Page 35

35

värden användes i ”Scenario 1 Genomsnittlig dag”. I den europeiska blankål medelvärdet vita muskeln

SUMT-koncentrationen var 1,8 nmol / g. Den genomsnittliga röda muskeln SUMT koncentration antogs

vara 5 gånger högre, baserat på ett antal observationer i europeiska och amerikanska ål och annan fisk

arter. Red muskler och lever hade liknande SUMT koncentrationer i aktivt simma fiskarter,

såsom Atlanten tonfisk ( thynnus thynnus ) och Atlanten makrill ( Scomber

scombrus ) 230 . Det fanns också betydande metabola likheter mellan röd muskler och lever i

den amerikanska ål 231.232 , och den röda muskeln hade ca 5 gånger högre aktivitet av glukos-6-fosfat

dehydrogenas, som katalyserar det hastighetsbegränsande reaktionen i hexosmonofosfatshunten, än den

vit muskel i den europeiska ålen 233 . Den SUMT koncentrationen i BR antogs vara 0,3

gånger SUMT koncentrations i levern. Den initiala CSBP SUMT koncentration inställdes på

1 nmol / g. Balans mellan disponibla och den föreskrivna SUMT i ”Scenario 1 Genomsnittlig dag” var

erhålles när SUMT koncentrationer i CSBP, vit muskel, och röd muskel reducerades till

hälften från början av migration till strax före leken.

För ”Scenario 2 Bästa dag”, en indikation på vad levern SUMT koncentration kan vara i en

icke-tiamin-deficient europeiska blankål erhölls genom extrapolering till noll latens i Fig. 4f,

som gav ett värde på 15,7 ± 1,9 nmol / g. Detta var mycket lik levern SUMT koncentrationen i

den fulla gruppen av de amerikanska gula ålar, som var 16,2 ± 2,8 nmol / g. Hence, en initial lever

SUMT koncentration av 16 nmol / g användes i ”Scenario 2 Bästa idag”. Den högsta vita muskeln

SUMT-koncentrationen observerats i amerikanska blankål i 2005 var 15,9 nmol / g 234 (fig. 4i), och

den initiala vita muskeln SUMT koncentrationen således satt till 16 nmol / g i ”Scenario 2 Bästa idag”.

Den högsta vita muskeln SUMT koncentrationen i de amerikanska gulål i simning

uthållighet experiment var 5,4 nmol / g. Det antogs att den vita muskeln koncentrationen kan

minska till detta värde under migration och mognad med bibehållen simkunnighet. De

Skillnaden mellan de genomsnittliga röda och vita muskel SUMT koncentrationer i aktivt simning

fiskarter kan sträcka sig från en faktor två upp till en storleksordning högre 235 . En faktor av

två valdes för ål i ”Scenario 2 Bästa dag” för att inte överskatta den röda muskeln

SUMT koncentration. Detta val motiverades av de metaboliska likheter mellan röd muskel

och lever beskrivits i samband med ”Scenario 1 Genomsnittlig dag” ovan, vilket indikerar att SUMT

koncentrationen bör inte skiljer sig alltför mycket mellan den röda muskler och lever. Inga ägg SUMT

koncentrationer i icke-tiamin-brist blankål fanns tillgängliga. Därför var litteraturen

undersökas för sådana ägg SUMT koncentrationer i andra fiskarter med jämförbara ägg storlekar och

larvutveckling (tabell S4). Dessa ägg SUMT koncentrationer, som kan komma från icke-

tiamin-deficient exemplar, låg i intervallet 11-19 nmol / g (tabell S4). den SUMT

koncentration i BR antogs vara 0,3 gånger SUMT koncentrationen i levern. De

initial CSBP SUMT koncentration inställdes på 2 nmol / g. Balans mellan disponibla och den föreskrivna

SUMT i ”Scenario 2 Bästa dag” erhölls när SUMT koncentrationen i omogna

gonad och de mogna ägg sattes till 13 nmol / g och de SUMT koncentrationer i CSBP och lever

minskades till hälften från början av migration till strax före leken.

De två modellscenarier har flera viktiga implikationer. För det första blankål göra en

massiva investeringar i deras reproduktion på bekostnad av den somatiska kroppen. För det andra, den vita

muskel är den dominerande källan till tiamin för ägg, medan exempelvis levern bidrar med endast

en mindre del. Samma fenomen har antytts också i atlantlax 236 . För det tredje, både

vit muskler och ägg i icke-tiamin-brist individer bör ha betydligt högre

SUMT koncentrationer än de har i genomsnitt blankål idag. SUMT koncentrationer av

---

Page 36

36

16 nmol / g i levern och vit muskel och 13 nmol / g i äggen av icke-tiamin-deficient silver

ål är verkligen rimligt. För det fjärde, jämförelse av tillgängliga SUMT i ”Scenario 1 Genomsnittlig dag”

med behov SUMT i ”Scenario 2 Bästa dag” visade att ca 80% av den nödvändiga tiamin är

saknas idag, och detta värde är troligen en underskattning, eftersom modellen inte redogöra för

förlust av tiamin genom metabolism och / eller utsöndring. Sådan clearance av tiamin under migreringen

till Sargassohavet förväntades vara signifikant genom Fitzsimons et al . 234 . Den allvarliga tiamin

brist anges här kan också förklara varför leptocephali, som produceras i laboratorium eller i

vattenbruk genom hormonbehandling av silver ålar t.ex. 237-240 , alla dör några dagar efter kläckning. Hittills är det

har misstänker att problemet är att hitta lämpliga mat för leptocephali efter att de har

konsumerade sin gulesäcken 218 och vissa framsteg har faktiskt gjorts i detta avseende 240 . Resultaten

presenteras här, dock tyder på att tiamin behandling av blankål och leptocephali kan

vara nödvändigt för framgångsrik produktion vattenbruk av ål på en regelbunden basis.

Det är anmärkningsvärt att den maximala vita muskeln SUMT koncentration i fylld gruppen av

Amerikanska gulål i simning uthållighet experiment var endast 5,4 nmol / g, medan

maximal muskel TDP koncentrationen i glasål var 13,9 nmol / g (fig. S4C), och den maximala

vit muskel SUMT-koncentrationen i blankål var 15,9 nmol / g (fig. 4i). Även i den gula

ålar analyseras av Fitzsimons et al . 234 , den maximala vit muskel SUMT koncentration, 4,1 nmol / g,

liknade den i fylld grupp av de amerikanska gulål. Som en förklaring, föreslår vi

att musklerna mer laddad med tiamin i flyttlivsstadier (glasål, glasål, och

blankål) än i de mer stillasittande livsstadier (gulål). Det har i själva verket visat sig

att omvandlingen av gulål till blankål är associerad med förändrade egenskaper hos

muskler, anpassa dem till en mer kontinuerlig simning aktivitet 241 .

Nedsatt lekvandring grund av tiaminbrist har påvisats i rainbow

öring 242 och coho lax ( O. kisutch ) 243 . Därför är det troligt att lekvandring försämras

även i de europeiska och amerikanska blankålar, som migrerar en betydligt längre sträcka (1.000

6000 km). Denna hypotes stöds av det faktum att simma uthållighet minskades vid

vit muskel SUMT koncentrationer som observerats i många vilda europeiska och amerikanska ålar idag

(Fig. 4i, j). Det har också visat sig att angrepp av A. crassus har en negativ effekt på

simning uthållighet 225 . Vår slutsats är dock att antalet denna parasit är relaterad till

tiaminbrist, troligen som en sekundär effekt av immunsuppression, öppnas det ytterligare

möjligheten att både parasiten angrepp och den negativa effekten på simning uthållighet är

orsakas av tiaminbrist. Dessutom har ett antal undersökningar påpekade

Betydelsen av en tillräcklig lipidhalt i muskeln för blankål övergång till deras lek

skäl 244-247 . Det är därför särskilt intressant att innehållet i den europeiska gul muskel lipid

ål har minskat i nära parallellt med rekryteringen av europeiska glasål i 21 europeiska

floder sedan omkring 1980 247 . Belpaire et al . 247 visade att muskel lipidhalten kan i själva verket

har minskat till en nivå som är otillräcklig för migration, gonad utveckling och lek.

Det är väl känt att tiaminbrist orsakar en minskning av kropps lipid reserver t.ex. 74.248 . Till

Såvitt vi vet den biokemiska mekanismen bakom detta relativt snabbt lipid utarmning

är okänd. Följaktligen kan det fenomen orsakas av ökad metabolisk användning av lipiderna,

minskade lipidsyntes, eller båda. Det kan hypotesen att en inhiberad hexos-monofosfat

shunt 249 , på grund av låg TK-aktivitet, resulterar i mindre NADPH tillgängliga för syntes av fettsyror.

En annan möjlighet är att en inhiberad citronsyracykeln stimulerar bildningen av acetyl-CoA

från β-oxidation av fettsyror. Det har i själva verket visat sig nyligen att hela citronsyra

---

Sidan 37

37

cykel, dvs inte bara KGDH, ändras av tiaminbrist 250.251 . Under de senaste åren, minskade

muskel lipidinnehåll och / eller minskad tillståndet har observerats även i andra arter av fisk,

såsom tånglake, sill, abborre ( Perca fluviatilis ), och skarpsill ( Sprattus sprattus ) 252-254 , däggdjur,

såsom tätningslister 254 , och fåglar, såsom sillgrissla ( Uria aalge ), ladusvala ( Hirundo rustica ), och

träd swallow ( Tachycineta bicolor ) 252.255.256 . Därför vi misstänker att även dessa observationer kan

vara ett resultat av den utbredda episod tiaminbrist.

---

Page 38

38

Salmonines (Salmoninae)

Relationerna mellan aktivitet och latens av TK och KGDH analyserades i föräldra

Atlantisk lax vid E1 i länet av Uppsala och I9 i länet av Blekinge (tabell S5a). De

backen var alltid negativt, och i tre fall av fem, de var signifikant skild från noll.

Hjärnan KGDH latenser var i intervallet 0-40% (Fig. 5b), och 21 av 30 prover hade en

hjärna KGDH latens över 6%. Förekomsten av nio prover med en hjärna KGDH latens

under 6% kan förklaras av det faktum att homeostas i hjärnan har prioritet över homeostas

i andra organ 82 . Relationerna mellan aktivitet och latens av TK och KGDH analyserades

även i atlantlax larver vid I9 (tabell S5a). Backarna var negativa i båda fallen med

en tendens till att vara skild från noll.

Ett antal könsskillnader observerades i föräldra atlantlax på E1 och I9

(Tabell S5b). Ju högre LSI i kvinnor än i män på I9 var troligen relaterat till

ökad hepatisk aktivitet i honorna i samband med deras äggproduktion ( t.ex. vitellogenin

produktion). Ju högre HSI, hematokrit och hjärna SUMT i män än hos honorna vid I9

kan tyda på högre tiamin status i hanar, eftersom de gör en mindre investering på

tiamin i reproduktion än honorna. I detta sammanhang var det oväntat att hitta högre

vit muskel SUMT koncentrationer i kvinnor än i hanar vid I9. Detta fenomen kan

relateras till det faktum att kvinnor lagrar tiamin i sina muskler för överföring till äggen , t.ex. 236 .

Högre lever TK-aktivitet i de män än hos honorna vid I9, samt högre lever KGDH

aktivitet och lägre KGDH latens i män än hos honorna vid E1, kan tyda på en högre

tiamin status i män än hos honorna på samma sätt som för HSI, hematokrit och hjärna

SUMT på I9. Det är anmärkningsvärt att vid E1 den extrapolerade lever KGDH aktivitet

15,8 ± 5,6 nmol / min / mg vid fördröjningen noll i honorna var nästan identisk med den genomsnittliga lever KGDH

aktivitet av 16,3 ± 2,1 nmol / min / mg i hanarna (Fig. S5i, Tabell S5b). Det var oväntat att finna

högre lever TK-aktivitet och lägre lever TK latens i honorna än i hanar vid E1. Eventuellt,

detta var ett resultat av olika historier av tiaminbrist (såsom diskuterats ovan för den gemensamma

ejder) mellan könen, på grund av deras olika investeringar i reproduktion.

Det positiva sambandet mellan vit muskel SUMT och totalvikt i föräldra Atlanten

lax vid I9 (fig. S5k) indikerar att tiamin status påverkar tillväxt. Också på E1, honor med

tiamin-brist-inducerad avkomma mortalitet (n = 129) hade lägre medeltotalvikten ( P = 0,0012)

och lägre medel SCI ( P = 0,0068) än kvinnor utan tiamin-brist-inducerad avkommor

mortalitet (n = 983), som analyserats med den parade Students t -test för åren 2007-2016 (ej

visad). I detta sammanhang är det intressant att både lax och havsöring fångas av fiske

vid Mörrums Kronolaxfiske (I9) har ökat i storlek sedan början av 1970-talet 257 . Eventuellt,

större individer med högre tiamin status prestera bättre än mindre individer när det

gäller migration och lek.

Precis som i de europeiska ålarna fanns ett positivt samband mellan hematokrit och

lever TK-aktivitet i föräldra atlantlax vid I9 (fig. S5n). Det fanns också en positiv

förhållandet mellan hematokrit och hjärnan SUMT (fig. S5o). Dessutom erytrocyt

hemoglobin negativt relaterad till levern TK-aktivitet (Fig. S5p) och hjärtat SUMT

(Fig. S5q). Möjligen, ökad erytrocyt hemoglobin, på grund av tiaminbrist, är ett sätt för

en individ för att kompensera för förlusten av erytrocyter observerades som minskad hematokrit. Det kan

---

Page 39

39

också vara så att minskad KGDH aktivitet i citronsyracykeln resulterar i minskad produktion av

reducerande ekvivalenter för andningskedjan, och att detta fenomen uppfattas av kroppen

som syreunderskottet, som miscompensated för genom produktion av erytrocyter med mer

hemoglobin.

Tiaminbrist var uppenbar även i lax larver, både i Östersjön lager

(E1, I9) och i Atlanten lager (K1). Lever TK-aktivitet var lägre i dessa grupper

jämfört med larver från tiamin-injicerade honorna som tidigare analyserats av Amcoff et al . 70

(Fig. S5R). Det fanns också ett negativt samband mellan lever TK-aktivitet och latens (Fig. S5-enheter).

Dessutom lever TK latenser av 23-44% enbart var tecken på allvarlig subletal tiamin

brist. Lever KGDH latenser av 2-21% observerades också (ej visad). extrapolering till

fördröjningen noll i Fig. S5-enheter gav en aktivitet av 4,0 ± 1,2 nmol / min / lever, jämförbar med den hos larver

från tiamin-injicerade honorna (fig. S5R).

Progressionen av tiamin bristsymtom börjar med molekylära förändringar vid den

subcellulär nivå, såsom minskningar i tiamin-beroende enzymaktiviteter och förändringar i

tiamin metabolism. Denna typ av förändringar följs av subcellulär och cellulär

ackumulering av toxiska metaboliter, t ex laktat. Detta i sin tur resulterar i skador på cell,

vävnad, och organnivåer, t ex nekros och blödning. I detta skede, makroskopiska symptom kan

börja utveckla, såsom försämrad tillväxt, förändrad beteende, minne och inlärningsstörningar,

infektionssjukdomar på grund av immunsuppression, och, slutligen, för tidig död. Kunskapen

om denna utveckling understryker vikten av observation av de tidiga, subletala symptom

av tiaminbrist, vilka uppträder vid väsentligt högre tiamin koncentrationer än de

associerad med direkt dödlighet. Inte förrän nyligen har dock den mest känsliga (subletala)

tiaminbrist biomarkörer undersökts hos vilda djur. Den tidigare fokus har varit

huvudsakligen på mortalitet.

Tidig dödlighet syndrom (EMS), M74 (från det svenska ordet ”miljöfaktor” (miljö

faktor) och år 1974), simma upp syndrom (SUS) och Cayuga syndrom (från Cayuga Lake, NY,

USA) är gamla termer myntade under de senaste decennierna för att beteckna tidigt livsfas dödlighet i salmonine

avkomma i området Stora sjöarna (Nordamerika) och Östersjöområdet. I mitten av 1990-talet, John

D. Fitzsimons upptäckte att vanlig orsak till dödligheten var tiaminbrist 258 och

sedan är det allmänt accepterat att alla fyra termer beskriva samma fenomen. Flera

uppföljningsundersökningar i Nordamerika och Östersjöområdet har bekräftat Fitzsimons'

första resultat 259-261 . Mycket av fokus har legat på fastställandet av tröskel SUMT nivåer för

dödlighet hos avkomman. Betyda initiala ägg koncentrationer av 0,25-3,9 nmol / g i grupper om

salmonines har observerats orsaka avkomma dödlighet i 8-100% av honorna 262-267 . De

högsta genomsnittliga initial ägg SUMT koncentration där en del av avkomman dog av tiamin

brist, var 3,9 nmol / g. Denna koncentration observerades i insjööring ägg och resulterade i

avkomma dödlighet hos 8% av honorna 265 . I fig. 5h, är 3,9 nmol / g som indikeras av en streckad linje som

tröskelnivån för dödlighet. Även andra författare har föreslagit en SUMT koncentration av ca

4 nmol / g i salmonine ägg som ett tröskelvärde för tiamin-brist-inducerad mortalitet 268-271 . Till

fullo förstå problemet med tiaminbrist är dock alltför snävt fokus på dödligheten.

Tiaminbrist är väl känd för att inducera en mångfald av negativa subletala effekter vid SUMT

koncentrationer är mycket högre än de som är associerade med direkt dödlighet ( dvs ägg SUMT

koncentrationer under ca 4 nmol / g). I salmonines har senaste arbete föreslagit ett antal

---

Page 40

40

subletala effekterna av tiaminbrist, såsom försämrad tillväxt 272 , minskad simning

uthållighet 242.243.273 , reducerad vison och utfodring 272.274 , och immunosuppression 62.275 . Följaktligen,

användningen av ”friska” som motsatsen till ”döda” är vilseledande och bör överges.

(Olyckligtvis har användningen av denna otillräckliga par av motstånd råder, t ex på många atlantlax

kompensations avel i Sverige med uppgift att stödja den lax lager i

Östersjön och Atlanten.) Genom att vrida fokus även subletala effekter, dödligheten

(EMS, M74, SUS, och Cayuga syndrom) visas snarare som spetsen på ett isberg. Det är därför av

yttersta vikt för att bestämma SUMT tröskeln för subletal tiaminbrist i salmonine

ägg, som vi föresatt sig att göra här, både genom mätningar i salmonines och genom återbesök existerande

litteratur inom detta vetenskapliga område. Tabell S5c innehåller en sammanställning av ägg SUMT koncentrationer

hos vilda salmonines från norra halvklotet, och Tabell S5D innehåller en motsvarande

sammanställning för salmonines vattenbruk. Dessa tabulerade ägg SUMT koncentrationer varierar från 4,1

till 66 nmol / g. Därför måste den verkliga tröskeln för subletal tiaminbrist ligga någonstans

inom detta intervall.

Även i vilda fåglar, har stor variation i äggula T koncentrationer observerats. I vår tidigare

undersökning av europeiska fåglar 1 , området av äggula T-koncentrationer var 0,026 till 30 nmol / g i

den ejder och 10-43 nmol / g i gråtrut. Det är högst osannolikt att ett ägg SUMT

max / min-förhållande av mer än en storleksordning, som i den ejder eller i

salmonines (0,25-66 nmol / g), skulle återspegla endast den naturliga variationen förväntas i en ren

ekosystem.

I båda fågel och fiskrom, är ungefär hälften av innehållet äggula, som innehåller det mesta av tiamin,

medan den vita innehåller bara lite tiamin 19,20 . Rapporterade T koncentrationer i fiskrom hänvisar till

hela ägg, medan rapporterade T koncentrationer i fågelägg hänvisar till äggulan. Detta bör tas

hänsyn till när man jämför T koncentrationer mellan fågel och fiskrom. Det rapporterade T

koncentration i en fisk ägg är ungefär hälften av den som rapporterats i en fågel ägg med samma äggula T

koncentration.

Tidigare undersökningar av salmonines har visat ett starkt samband mellan SUMT

koncentrationer i nyligen befruktade ägg, synat ägg och larver post kläcks 208.276 . Detta fenomen

bekräftades i denna undersökning (nyligen befruktade ägg vs. synat ägg, r = 0,92,

P = 0,00019, n = 10; nyligen befruktade ägg vs. larver 166-175 d ° C efter kläckning, r = 0,96, P <0,0001,

n = 10; synat ägg vs. larver 166-175 d ° C efter kläckning, r = 0,95, P <0,0001, n = 10; inte visad). Det har

också observerats tidigare att nyligen befruktade ägg med en högre SUMT koncentration förlora

tiamin i högre takt under sin utveckling än nyligen befruktade ägg med en lägre SUMT

koncentration 208,276-279 . Uppenbarligen finns det mekanismer för bevarande av tiamin när

initiala ägg SUMT koncentrationerna är låga. I denna undersökning, ägg SUMT koncentrationer i

den atlantlax vid I9 var mycket låg (medelvärde = 5,2 nmol / g) och minskade endast litet under

utveckling.

Fenomenet att somatiska vävnader har en övre gräns för hur mycket tiamin de kan hålla,

såsom beskrivs i Metoder, är särskilt slående i djurexperiment med tiamin doser

som kan vara storleksordningar högre än fysiologiska koncentrationer 280,281 . i Atlantic

lax, experimentellt exponerats för olika doser av T i maten, Fynn-Aikins et al . 282

visade mättnad av SUMT i levern, muskler, hjärta och njurar. För salmonine ägg,

---

Page 41

41

Men det verkar inte finnas någon uppenbar övre gräns för hur mycket tiamin de kan hålla

(Tabellerna S5c, d), och det visas att de innehåller ibland mer tiamin än vad som är nödvändigt för

produktion av helt icke-tiamin-brist avkomma. Till exempel kost tiamin

kraven i flera arter av domestice eller försöksdjur är avsevärt lägre än

de högsta tiamin koncentrationer observerade i salmonine ägg (tabellerna S5c, d). Dessutom, en

stark linjärt samband ( P = 0,00044, R ^ = 0,80) mellan T-koncentrationer i dieten och den

äggula har visats i tamhöns, åtminstone i kosten T intervallet 4-20 nmol / g

foder 283 . En konsekvens av denna skillnad mellan somatiska vävnader och ägg är att tröskeln

för subletal tiaminbrist lättare bestämmas i somatiska vävnader än i ägg. I

somatiska vävnader, är det möjligt att mäta aktiviteten och latens av tiamin-beroende enzymer, såsom

samt tiamin-brist-inducerade toxiska metaboliter, av vilka ingen är producerade i äggen.

Det finns också information i graden av fosforylering av tiamin i somatiska vävnader,

medan äggen innehåller mestadels T. För att bestämma tröskeln för subletal tiamin

brist på salmonine ägg, var det nödvändigt att studera utvecklingen av larver som härrör från

ägg med olika T-koncentrationer.

Fig. 5h visar original och litteraturuppgifter på ägg SUMT koncentrationer i salmonines från

Norra halvklotet, inklusive Stilla havet, de stora sjöarna i Nordamerika, östra

Atlanten och Östersjön. De litteraturdata i fig. 5h är ett urval från tabellerna S5c, d.

Fyra tröskelnivåer för tiamin-brist-inducerade hälsoeffekter anges med horisontella

rader:

• Linje (A) vid 3,9 nmol / g anger tröskeln för dödlighet i larver, såsom beskrivits ovan.

• Linje (B) vid 8,3 nmol / g anger tröskelvärdet för 20% reducerad specifik tillväxthastighet (SGR) i

larver av insjööring 272 .

• Linje (C) vid 12 nmol / g indikerar en tröskel för lever TK latens i föräldra atlantlax

honor.

- Ett negativt samband mellan ägget SUMT och levern TK latensen hittades i 25

Atlantlax honor i två svenska floder, E1 och I9 (Fig. 5e). detta förhållande

visar att ägg tiamin status är direkt relaterad till tiamin status av den kvinnliga.

Extrapolering till noll latens gav ett ägg SUMT koncentration av 11,7 ± 2,3 nmol / g. Noll

latens betyder inte nödvändigtvis dock att motsvarande ägget SUMT

koncentrationen är tillräckligt för att producera helt icke-tiamin-deficient avkomma. För

Exempelvis kan lever TK latens inte vara den mest känsliga av alla tiaminbrist

biomarkörer, eller levern TK-aktivitet kan minskas permanent, på grund av tidigare episoder

av tiaminbrist. En tendens till en sådan permanent minskning framgår av Fig. 5e om

E1 och I9 atlantlax analyseras separat. Ju mer tiamin-brist E1

prover skulle ge en ännu lägre extrapolerad ägg SUMT koncentration om analyseras

ensam. Därmed bör ett ägg SUMT koncentration av 12 nmol / g anses som ett minimum

tröskeln för lever TK latency i föräldra kvinnliga.

• Linje (D) vid 17-19 nmol / g indikerar en möjlig tröskelområdet för subletal tiamin

brist.

- Enligt den exponentiellt förhållande presenteras av Fitzsimons et al . 272 en minskning 2%

i SGR av larverna i insjööring sker vid ett ägg SUMT koncentration av 17 nmol / g.

Under antagande att en minskning av SGR 2% ligger inom felmarginalen, kan 17 nmol / g vara en

tröskeln för minskad tillväxt av larverna.

---

Page 42

42

-. Tröskel T koncentrationen i vitt muskel hos atlantlax i fig 5g var 17-

19 nmol / g. Enligt sambandet i Fig. 5f, denna vita muskel T koncentrationsintervall

motsvarar ett ägg T koncentrationsområdet av 15-20 nmol / g. Därför ett ägg SUMT

koncentration av ca 18 nmol / g kan vara en tröskel för subletal tiaminbrist.

- I vår tamhöns experiment en genomsnittlig lever TK latens på 40% motsvarar en

tyda på lever SUMT koncentration av 5 nmol / g (n = 15, ej visad), medan levern SUMT

tröskeln för noll lever TK latens var 18 nmol / g (n = 7, visas ej). Dessa SUMT värden

skiljer sig med en faktor av 3,6. Den genomsnittliga lever TK latens i lax larver på I9 var

också 40% (intervall 35-44%, n = 10, Fig. S5-enheter), och de kom från ägg med ett medelvärde SUMT

koncentration av 5,1 nmol / g (intervall 3,4-7,3 nmol / g, n = 14, fig. 5e, f). Om samma faktor

3,6, som i den inhemska kycklinglever, appliceras på Atlanten lax ägg på I9, den

resulterande tröskel för lever TK latens i larverna blir ca 18 nmol / g, som kan vara

en tröskel för subletal tiaminbrist.

- Stöd för 17-19 nmol / g som en möjlig tröskelområde kommer också från förment icke-

tiamin-deficient vattenbruk salmonines (tabell S5D), som hade ägg SUMT

koncentrationer i området från 18 till 62 nmol / g.

Såsom beskrivits ovan, en SUMT koncentration av 18 nmol / g i salmonine ägg motsvarar ungefär

36 nmol / g i gråtrut äggula, vilket verkar vara tillräckligt för produktion av friska

avkommor 1 . Kanske finns det biokemiska likheter mellan olika klasser av djur i

tiamin efterfrågan på den växande embryo. Dessutom undersökningen genom Fitzsimons et al . 272

indikerade att ett ägg SUMT koncentration av 19 nmol / g i insjööring är ingen överskattning av

tröskeln för subletal tiaminbrist, eftersom denna koncentration var associerad med en 6%

reduktion i födosök hastigheten i larver.

Acceptera en SUMT koncentration av 17-19 nmol / g som tröskelnivå för subletal tiamin

brist på färska salmonine ägg leder till ett nytt perspektiv, där en mängd subletala

effekter är att vänta under denna nivå, förutom direkt dödlighet. Några av dessa subletal

effekter som beskrivs ovan, men mer är att vänta, eftersom vi har använt endast en begränsad

antalet biomarkörer. Om det finns andra, mer känsliga biomarkörer än de uppmätta här,

även tröskeln 17-19 nmol / g kan vara en underskattning. Till exempel, den tiamin-beroende

enzym pyruvatdehydrogenas har indikerats som mer känsliga för tiaminbrist än

TK 284 . Fig. 5h och tabell S5c visar att det finns en hög sannolikhet för subletala effekterna av tiamin

brist på många salmonines på norra halvklotet. Frånvaron av synliga mortalitet

bland salmonine avkomma inte bör ses som ett bevis på full hälsa. Det har i själva verket varit

demonstreras i insjööring larver som subletala effekterna av tiaminbrist, såsom minskad

SGR och reducerad födosök hastighet, inträffade i en mycket större andel av befolkningen än direkt

tiamin-brist-inducerad dödlighet gjorde 272 . Tiaminbrist kan också resultera i försämrad

hälsa i senare skeden i livet än larverna. Det är väl känt att tiaminbrist kan orsaka lång

varaktiga subletala effekter. Hence, både tidigare och nuvarande episoder av tiaminbrist kan

bidra till försämrad hälsa på ett visst stadiet. I detta sammanhang är det intressant att hastigheten vid

som lax avkomma avkastning som vuxna för lek, har minskat i många områden i

Norra halvklotet under de senaste två decennierna 285-289 . Vi misstänker att tiaminbrist att vara

viktig orsak till den negativa utvecklingen. Denna förklaring har faktiskt redan föreslagits

för atlantlax i svenska älvar 290 . Ytterligare bevis ges av Friedland et al . 288 ,

---

Page 43

43

som observerade att den europeiska atlantlax rekryteringen tycks styras av faktorer som

påverka tillväxten av efter smolt under sin första sommar på sjön.

Fig. S5t, u, med data från nio floder i Östersjöområdet, visar att tiamin

brist på atlantlax inträffar episod i både tid och rum. Den genomsnittliga kurvan är

presenteras separat i Fig. S5t för tydlighets skull. Det bör dock noteras, att den genomsnittliga kurvan

inte står för mycket av den variation som visas i fig. S5u. Den genomsnittliga kurvan beror också

på de olika mätperioderna av floderna. Det kan vara särskilt noteras att i Fig. S5u att

Skillnaderna är stora, både mellan floderna ett visst år, och mellan år för en viss flod.

Kanske denna episodiska mönstret är mer påtaglig mellan åren än mellan floder (fig. S5u).

Med tanke på ovanstående diskussion om subletala effekterna av tiaminbrist, observation av

nollfrekvensen hos honor med tiamin-brist-inducerad mortalitet hos avkomman i vissa av

floderna några av åren betyder inte att avkomman var fri från subletala effekter.

Motsvarande övervakningsdata från Nordamerika är inte tillgängliga, men det är mest troligt att

den tiaminbrist inträffar episod där också. Detta är i själva verket, som anges av tabell S5c,

där många ägg SUMT koncentrationer skiljer sig i hög grad mellan provtagningstillfällen på vissa platser.

Dessutom, 77% av den Chinook lax ( Oncorhynchus tshawytscha ) honor från Yukon

Flod i Alaska, USA, producerade ägg med en medel SUMT koncentration av <8,0 nmol / g i 2012 291 .

Slutligen bör man komma ihåg att människans hantering av salmonine populationer skymmer

den fulla effekten av tiaminbrist. Till exempel var drivgarn förbjudna i Östersjön

2008 292 , och tiamin bad av salmonine ägg och larver i vattenbruk är vanligt i den stora

Lakes (USA och Kanada) 209 och har utförts i viss utsträckning, utan bokföring,

även i Östersjöområdet. Båda åtgärderna kommer sannolikt att påverka salmonine lager.

---

Page 44

44

Sill ( Clupea harengus )

Eftersom de analyserade sill hade migrerat till sina lekområden i rätt tid av

år och var starka nog att fånga jiggen av kastspön, utgjorde de förmodligen en icke-

slumpmässigt urval av Östersjön sill befolkningen. I motsats till de flesta andra fält material som ingår

i vår undersökning, dessa sill var huvudsakligen icke-tiamin-brist. Ändå, trots att

lekområden vid I8 i Blekinge län är traditionellt kända för sitt överflöd

av lekande sill, var relativt intensivt fiske nödvändig för att erhålla det undersökta materialet.

I genomsnitt ca två timmars aktiv fiske var nödvändiga för att fånga varje sill. Detta kan tyda

att överflödet av lekande sill kan vara lägre än vad som tidigare, eller vara en följd av

det faktum att sillen inte äta (fångar jiggen) under lek 293-295 .

De tiaminbrist biomarkörer nivåer för varje kön presenteras i tabell S6. köns~~POS=TRUNC skillnader~~POS=HEADCOMP

erhölls för LSI, lever SUMT, lever SUMT somatisk index (SI), och lever / hjärna SUMT förhållande. Dessa

skillnader alla hänför sig till levern och är relaterade till varandra. Ju högre LSI i honorna

(1,7 ± 0,3%) än i de män (0,6 ± 0,0%) var mest sannolikt relaterade till ökad hepatisk aktivitet

i honorna i samband med deras äggproduktion ( t.ex. vitellogenin produktion). Det är troligt

att lever SUMT koncentrationen dämpas i levern hos honorna och därmed lägre än i

hanarna. I detta sammanhang var intressant att analysera levern SUMT SI, som visade att

honorna, i själva verket hade mer lever SUMT i förhållande till deras somatiska vikt än hanarna. De

högre lever / hjärna SUMT förhållandet i män än hos honorna, förklarades av kön skillnaden

i lever SUMT kombinerat med någon könsskillnad i hjärnan SUMT. Slutsatsen är att det inte fanns

ingen uppenbar könsskillnad i tiamin status.

SCI och GSI för båda könen (Tabell S6) kommit överens med litteraturdata på sill redo att leka 296 .

För lever och hjärna SUMT koncentrationer inga litteraturdata på icke-tiamin-brist sill var

tillgängliga. Jämfört med andra fiskar i denna undersökning, dock i genomsnitt lever SUMT

koncentrationer av 13,7 ± 2,8 nmol / g i honorna och 21,1 ± 4,0 nmol / g i hanarna var relativt

hög och kan mycket väl vara representativa för icke-tiamin-brist individer. Den genomsnittliga hjärnan

SUMT koncentration av 27,8 ± 1,2 nmol / g (poolade könen, n = 11, visas ej) var anmärkningsvärt hög

och resulterade i en lever / hjärna SUMT förhållande under ett, vilket i många andra arter skulle indikera

tiaminbrist. För dessa sill, dock andra tiaminbrist biomarkörer

indikerade en relativt hög tiamin status, så det låga SUMT förhållandet lever / hjärna i denna art kan

betraktas som exceptionellt. Medelvärdet vita muskeln SUMT koncentration av 6,3 ± 0,6 nmol / g

(Poolade könen, n = 20, visas ej) var väsentligt högre än för andra sill i Östersjön

Hav. Till exempel Sylvander & Bignert 79 rapporterade genomsnittliga muskel SUMT koncentrationer av 2.59-

3,61 nmol / g i material från 1995-2011. I I8 material, det fanns inga relationer mellan

proportionen TDP och T-koncentrationen, varken i levern (fig. S6a) och inte heller i hjärnan

(Fig. S6b). Det var verkligen ett negativt samband mellan levern TK aktivitet och latens

(Fig. S6c), men de latenser var högst 6%. I hjärnan fanns inget samband mellan

TK-aktivitet och latens (Fig. S6d), och inte heller i levern (fig. S6e), och inte heller i hjärnan (Fig. S6F),

fanns någon relation mellan KGDH aktivitet och latens. Mean TK latenser i levern

och hjärna och betyda KGDH latens i levern var alla lägre än 2% (Tabell S6), medan den

betyda KGDH latens i hjärnan var 6,6 ± 4,3% (poolade könen, n = 9, ej visad). Detta högre värde

berodde främst på tre exemplar med latenser av 12-15%, vilket inte har någon tydlig tolkning.

Det övergripande mönstret var en hög tiamin status för sill, vilket bevisar att icke-thiamine-

---

Page 45

45

bristfälliga individer kan fortfarande finnas i området, även om de kanske inte är representativ för

hela befolkningen.

---

Page 46

46

ytterligare Tack

Vi tackar J. Källström (Blekinge län, Sverige) för outtröttlig hjälp, liksom all annan personal på

i Johannishus Manor, för deras snabba logistiskt stöd under flera provtagningskampanjer. Vi

också tacka ornitologen L. Carlsson (Blekinge län) för värdefull hjälp i många olika

sätt. A. Granhed (Scanfjord Mollösund AB, Mollösund, Sverige) försedd blåmusslor från

den svenska västkusten. När du arbetar på Island fick vi mycket uppskattat hjälp och logistik

stöd från H. Guðmundsson (Flatey), G. Þ. Hallgrimsson (University of Iceland), liksom H.

Helgason, E. Palsdottir, S. Valdimarsson och annan personal vid Reykjanes Environmental

Research Institute i Sandgerði. Vi har visat stor gästfrihet av AV Ásgeirsson på

Álfheimar pensionat i Bakkagerði, Borgarfjörður Eystri. Värdefull hjälp var också av

Magnús Þorsteinsson på Höfn i Hafnarhólmi, Borgarfjörður Eystri. Vi erkänner tack

all teknisk och praktiskt stöd från personalen vid fiskeriforskningsinstitutet Station i

Älvkarleby (Dalälven, Sverige), på Mörrums Krono (Mörrumsån, Sverige),

och Statkrafts lax vattenbruksanläggning i Laholm (Lagan, Sverige). vid Mörrums

Kronolaxfiske, vi särskilt erkänner C. Elg, P. Karlsson, H. Persson, H. Olsson, U. Sill, O.

Söderdahl, och A. Sörensson för deras engagerade stöd i allt arbete med lax och hav

Forell. Vi vill också att fira intresset och kräsna initiativ

av P. Assarsson, tidigare chef för Mörrums Kronolaxfiske, vars ytterligare deltagande i detta

Projektet förhindrades av hans tidiga död i december 2011. S. Palm (svenska universitet

Lantbruksuniversitet, SLU) utförde genetisk analys av den vuxna lax från floden

Mörrumsån. Tack vare honom kunde vi utesluta vissa hybrider mellan lax och

havsöring från vårt material. W. Dekker, A. Fjälling, och H. Wickström (SLU), samt J.

Christiansson (Karlstads universitet, Sverige), under förutsättning att värdefull hjälp i arbetet med ål. M.

Rinaldo och hennes familj vänligt tillhandahålls rådata från 100 år undersökning av ejder bon

i Lygne Skärgård (Sverige). R. Hansson översatta artiklar skrivna på ryska och förutsatt

värdefulla synpunkter på manuskriptet. M. Sapounidou är känd för givande diskussioner.

Tack också för att J.-O. Persson, medlem i det statistiska forskargrupp vid institutionen för

Matematik vid Stockholms universitet (Sverige) för konstruktiva statistisk rådgivning. Vårt arbete var

möjliggjorts genom tillgång till kärnanläggningar vid Institutionen för miljövetenskap och

Analytical Chemistry (ACES) vid Stockholms universitet. M. Hanson (ACES) vänligen hjälpt oss

den tiamin analyser. Slutligen vill vi tacka M. Breitholtz (ACES), JW DePierre (Stockholm

University), JD Fitzsimons (Department of Fisheries och Oceans, Burlington, ON, Kanada), R.

Holt (Oregon State University, Corvallis, OR, USA), CE Kraft (Cornell University, Ithaca, NY,

USA), Kjell Larsson (Linnéuniversitetet, Växjö, Sverige), SV Marcquenski (Wisconsin

Department of Natural Resources, Madison, WI, USA), och DE Tillitt (US Geological Survey,

Columbia, MO, USA) för deras stora intresse för vårt arbete och deras kunnig support och

råd. All användning av handel, produkt eller fasta namn i denna artikel är i beskrivande syfte endast och

innebär inte godkännande av den amerikanska regeringen.

---

Page 47

47

Figur S1. Stationer där prover samlades in. Svart: blåmussla ( Mytilus sp .). Grön:

ejder ( Somateria mollissima ). Pink: Lax ( Salmo salar ). Orange:

klorofyll a . ( A ) South-western Iceland (A). ( B ) Norra Island (B). ( C ) nordöstra Island

(C). ( D ) Östra Island (D). ( E ) Uppsala län, Sverige (E). ( F ) Län från Stockholm, Sverige

(F). ( G ) Län av Södermanland (G). Kartorna skapades med GIMP 2.8.16

( http://www.gimp.org/downloads/ ).

en

b

c

d

e

f

g

---

Page 48

48

Figur S1 (fortsättning). Stationer där prover samlades in. Svart: blåmussla ( Mytilus sp .).

Grön: ejder ( Somateria mollissima ). Gray: europeisk ål ( Anguilla anguilla ) eller

American ål ( A. rostrata ). Pink: Lax ( Salmo salar ). Brown: havsöring ( S. trutta ).

Vit: sill ( Clupea harengus ). ( H ) Län av Östergötland (H). ( I ) Län av

Blekinge (I). ( J ) Län av Skåne (J). ( K ) Län av Halland (K). ( L )

Gloucestershire, UK (L). ( M ) Maryland, USA (M). ( N ) Massachusetts, USA (N). ( O ) Quebec,

Canada (O). Kartorna skapades med GIMP 2.8.16 ( http://www.gimp.org/downloads/ ).

h

jag

j

k

l

m

n

o

---

Page 49

49

en

b

c

d

e

f

g

h

Figur S2. Blåmussla ( Mytilus sp .). ( A ) Koncentration och proportion mjuk kropps T, TDP, och

TMP i isländska prover med låg SUMT. ( B ) Digestive körtel TK-aktivitet och latens i

provstycken vid G1 i Södermanland experimentellt utsattes för olika tider av

hypoxi och hypertermi. ( C ) Digestive körtel TK-aktivitet och mjuk kropp (förutom matsmältningskörtel)

SUMT i Östersjön. ( D ) Digestive körtel TK latens och SUMT i experimentell vattenbruk

prover från den svenska västkusten. ( E - g ) Digestive körtel TK-aktivitet och latens i Icelandic

prover. ( E ) A4 i sydvästra Island. ( F ) B1 i norra Island. ( G ) C2 i nordöstra

Island. ( H ) Digestive körtel TK-aktivitet på Island (blå) och Östersjön (röd). ANOVA-

typ regressionsmodell. ● Bars: aritmetiska medelvärden. Whiskers: 95% CI. C: kontroll. OLS: vanliga

minsta kvadratregression. GM: geometriska medelvärdet regression.

T 0,4%

TDP 90,5%

TMP 9,1%

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

4

4,5

5

Island 0,91 <SUMT <1,07 n = 24

S

oft b

od

y

c

på

c

sv

tration

(nm

ol / gw

w

)

P <0,0001

R ^ = 0,55

G1

n = 31

0

2

4

6

8

10

12

14

16

-2

2

6

10

14

18

22

26

30

Dige

s

tiv

e glan

d T

K

växelström

tiv

ity

(nm

ol / m

i / m

g)

Matsmältningskörtel TK latens (%)

Kontrollera

2 dagar

4-5 dagar

P = 0,023

R ^ = 0,28

Östersjön (F, G, I)

n = 18

0

2

4

6

8

10

12

0

0,5

1

1,5

2

Dige

s

tiv

e glan

d T

K

växelström

tiv

ity

(nm

ol / m

i / m

g)

Mjuka kropps SUMT (nmol / g ww)

vattenbruk

n = 11

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

0

0,5

1

1,5

2

2,5

Dige

s

tiv

e glan

d T

K

sent

nc

y

(%)

Matsmältningskörtel SUMT (nmol / g ww)

y = -27.4ln (x) + 21,1

R ^ = 0,66

P = 0,0097

R ^ = 0,17

A4 W25

n = 38

0

2

4

6

8

10

12

14

16

-2

2

6

10

14

Dige

s

tiv

e glan

d T

K

växelström

tiv

ity

(nm

ol / m

i / m

g)

Matsmältningskörtel TK latens (%)

OLS

GM

P = 0,65

R ^ = 0,0073

B1 w42

n = 30

0

2

4

6

8

10

12

14

16

-2

2

6

10

14

Dige

s

tiv

e glan

d T

K

växelström

tiv

ity

(nm

ol / m

i / m

g)

Matsmältningskörtel TK latens (%)

P = 0,10

R ^ = 0,093

C2 W41

n = 30

0

2

4

6

8

10

12

14

16

-2

2

6

10

14

Dige

s

tiv

e glan

d T

K

växelström

tiv

ity

(nm

ol / m

i / m

g)

Matsmältningskörtel TK latens (%)

C

**

**

***

***

0

2

4

6

8

10

12

A4

W25

n = 38

G1

Sommar

n = 36

G1

Höst

n = 36

B1

w42

n = 30

C2

W41

n = 30

Dige

s

tiv

e glan

d T

K

växelström

tiv

ity

(nm

ol / m

i / m

g)

---

Page 50

50

jag

j

k

l

m

n

o

p

q

Figur S2 (fortsättning). Blåmussla ( Mytilus sp .). ( I , j ) Torr kroppsvikt med exemplar av olika

längder. Streckade linjer: 95% CI. ( I ) Utanför den reproduktiva perioden på G1 2011-2012 (röd / svart,

denna undersökning) och Vrångskär i Södermanlands län 1972-1973 (grön, anpassad från

Kautsky 7 ). ( J ) mars-juli kl G1 2011-2012 (röd / svart, denna undersökning) och väster om Hangö

halvön, Finland, 1992 (grön, anpassad från Öst & Kilpi 8 ). ( K ) Förhållande mellan torr kropp

vikt och våtvikten baserade BCI i två längdgrupper från G1. Varje markering representerar

aritmetiska medelvärdet på ett provtagningstillfälle. ( L ) BCI i Östersjöområdet under hösten 2011.

ANOVA. ( M ) Mjuk kropp SUMT (röd) och BCI (orange) vid G1 i Södermanland. ( N , o )

BCI och mjuk kropp SUMT på I5 i länet av Blekinge 2011. ( n ) Vecka 22. ( o ) Vecka 43. ( p , q )

BCI och mjuk kropp SUMT vid G1 2011. ( p ) Vecka 42. ( q ) Vecka 51. ● Bars: aritmetiska medelvärden.

Whiskers: 95% CI.

G1

n = 726

0,00

0,02

0,04

0,06

0,08

0,10

0,12

0,14

0,16

0,18

15

20

25

30

35

40

D

ry

kropp

w

åtta (g per ind

idual)

Skallängd (mm)

G1 2011-12

G1 2011-12

G: Vrå. 1972-1973

G1

n = 456

0,00

0,02

0,04

0,06

0,08

0,10

0,12

0,14

0,16

0,18

15

20

25

30

35

40

D

ry

kropp

w

åtta (g per ind

idual)

Skallängd (mm)

G1 2011-12

G1 2011-12

Hanko W 1992

P <0,0001

R ^ = 0,78

P <0,0001

R ^ = 0,71

0

0,01

0,02

0,03

0,04

0,05

0,06

0,07

0,08

0,09

0

0,1

0,2

0,3

Torr

bo

dy

w

eigh

t (gp

er ind

iv

IDU

al)

BCI (g / cm)

G1 21 mm n = 247

G1 29 mm n = 183

en

b

b

0

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

0,3

F4-8 W41

n = 162

G1 w42

n = 72

I1-7 w43

n = 219

B

Cl (g / c

m

³)

r = 0,35

P = 0,20

0

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4

1,6

1,8

0

10

20

30

40

50

B

Cl (g / c

m

³)

Så

ft b

od

y

Su

m

T

(nm

ol / gw

w

)

Week 2011

SUMT

istäcket

BCI

P = 0,00031

R ^ = 0,74

I5 W22

n = 12

0

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

0,3

0,35

0,4

0

0,5

1

1,5

2

B

Cl (g

/ c

m

³ w

w

)

Mjuka kropps SUMT (nmol / g ww)

P = 0,31

R ^ = 0,050

I5 w43

n = 23

0

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

0,3

0,35

0,4

0

0,5

1

1,5

2

B

Cl (g

/ c

m

³ w

w

)

Mjuka kropps SUMT (nmol / g ww)

P = 0,31

R ^ = 0,055

G1 w42

n = 21

0

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

0,3

0,35

0,4

0

0,5

1

1,5

2

B

Cl (g

/ c

m

³ w

w

)

Mjuka kropps SUMT (nmol / g ww)

P = 0,0041

R ^ = 0,41

G1 W51

n = 18

0

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

0,3

0,35

0,4

0

0,5

1

1,5

2

B

Cl (g

/ c

m

³ w

w

)

Mjuka kropps SUMT (nmol / g ww)

---

Page 51

51

en

b

c

d

e

f

g

h

jag

Figur S3. Ejder ( Somateria mollissima ) och tamhöns ( Gallus gallus ). ( A , b )

Tamhöns tiamin ”komplett” grupp (grön, 17,5 nmol T per g torrt foder) och tiamin

”Deficient” -grupp (orange, 1,2 nmol T per g torrt foder), ejder honor vid D3 i östra

Island (blå) och I10-14 i Blekinge län (röd). Students t -test. ( A ) Lever TMP. ( b )

Andel lever TDP. ( c ) Tama kyckling respons i proportion lever TDP till olika doser av

T i den torra foder. ( D , e ) Andel TDP och T-koncentrationen i lever och hjärna av inhemsk

kyckling ges olika doser av T i det torra fodret. ( D ) Lever. ( E ) Brain. ( F - i ) Ejder

honor vid C1 och D3 i nordöstra och östra Island (blå) och vid I10-14 i län

Blekinge (röd). ( F ) Andel lever TDP och lever T koncentration. ( G ) Andel hjärnan TDP och

hjärna T-koncentration. ( H ) Lever TK-aktivitet och latens. ( I ) Lever KGDH aktivitet och latens. ●

Bars: aritmetiska medel. Whiskers: 95% CI. Gruppjämförelser anges med klamrar.

***

ns

0

2

4

6

8

10

12

D. kyckling

komplett

n = 14

D. kyckling

bristfällig

n = 15

C. eider

D3

n = 10

C. eider

I10-14

n = 23

Liv

er T

MP (nm

ol / gw

w

)

***

ns

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

D. kyckling

komplett

n = 14

D. kyckling

bristfällig

n = 15

C. eider

D3

n = 10

C. eider

I10-14

n = 23

Andel

liv

er T

D

P (%

)

tamhöns

n = 53

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

0

2

4

6

8

10

12

P

rop

ortion

liv

er T

DP

(%)

T dos (nmol / g torr foder)

P <0,0001

R ^ = 0,75

tamhöns

Dos: 1,5-10 nmol / g

n = 30

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

P

rop

ortion

liv

er T

DP

(%

)

Lever T (nmol / g ww)

P <0,0001

R ^ = 0,70

tamhöns

Dos: 1,5-10 nmol / g

n = 30

50

55

60

65

70

75

80

85

90

95

100

0

0,05

0,1

0,15

P

rop

ortion

hjärna T

DP

(%)

Hjärna T (nmol / g ww)

P = 0,030

R ^ = 0,14

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

0

0,5

1

1,5

P

rop

ortion

liv

er T

DP

(%)

Lever T (nmol / g ww)

C1, D3 n = 12

I10-14 n = 23

Allmänning

ejder

P = 0,033

R ^ = 0,38

P <0,0001

R ^ = 0,64

50

55

60

65

70

75

80

85

90

95

100

0

0,1

0,2

0,3

0,4

P

rop

ortion

hjärna T

DP

(%)

Hjärna T (nmol / g ww)

C1, D3 n = 12

I10-14 n = 23

Allmänning

ejder

P = 0,016

R ^ = 0,16

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

-5

0

5

10

15

Liv

er T

K

växelström

tiv

ity

(nm

ol / m

i / m

g)

Lever TK latens (%)

C1, D3 n = 12

I10-14 n = 23

Allmänning

ejder

P = 0,0088

R ^ = 0,55

P <0,0001

R ^ = 0,82

0

5

10

15

20

25

30

0

20

40

60

80

Liv

er K

G

DH ac

tiv

ity

(nm

ol / m

i / m

g)

Lever KGDH latens (%)

C1, D3 n = 11

I10-14 n = 23

Allmänning

ejder

---

Page 52

52

j

k

l

m

n

o

Figur S3 (fortsättning). Ejder ( Somateria mollissima ) och tamhöns ( Gallus

gallus ). ( j ) Brain KGDH aktivitet och latens i ejder honor vid C1 och D3 i nord

östra och östra Island (blå) och I10-14 i Blekinge län (röd). ( k ) Maximal

lever KGDH aktivitet i ejder honor vid C1, D3, och I10-14 med noll döda avkomma eller

åtminstone en död avkomma i äggen. Students t -test. ( L - n ) ejder honor vid C1 och D3.

( L ) Lever EROD-aktivitet och lever SUMT. ( M ) Lever EROD-aktivitet och lever / hjärna TDP-förhållande. ( n )

Lever EROD-aktivitet och LBI. ( o ) neuropil vakuolisering i de djupa cerebellära kärnor av en thiamine-

bristfällig tamhöns. En opåverkad område ses till det nedre högra. H & E-färgning. ● Bars:

aritmetiska medel. Whiskers: 95% CI.

P = 0,0055

R ^ = 0,22

0

2

4

6

8

10

12

14

16

-5

0

5

10

15

20

B

regn K

G

DH ac

tiv

ity

(nm

ol / m

i / m

g)

Hjärnan KGDH latens (%)

C1, D3 n = 11

I10-14 n = 23

Allmänning

ejder

*

0

5

10

15

20

25

30

Honor (C, D, I) med

0 döda avkomma i

äggen n = 22

Honor (C, D, I) med

≥1 döda avkomma i

äggen n = 12

Liv

er K

G

DH m

yxa

-växelström

tiv

ity

(nm

ol / m

i / m

g)

Allmänning

ejder

P = 0,027

R ^ = 0,40

ejder

C1, D3

n = 12

0

20

40

60

80

100

120

0

5

10

15

20

Liv

er E

RO

D ac

tiv

ity

(e.m

ol / m

i / m

g)

Lever SUMT (nmol / g ww)

P = 0,015

R ^ = 0,46

ejder

C1, D3

n = 12

0

20

40

60

80

100

120

0

0,5

1

1,5

Liv

er E

RO

D ac

tiv

ity

(e.m

ol / m

i / m

g)

Lever / hjärna TDP-förhållande

P = 0,017

R ^ = 0,45

ejder

C1, D3

n = 12

0

20

40

60

80

100

120

0

0,5

1

1,5

2

Liv

er E

RO

D ac

tiv

ity

(e.m

ol / m

i / m

g)

LBI (%)

---

Page 53

53

en

b

c

d

e

f

g

h

jag

Figur S4. Europeisk ål ( Anguilla anguilla ). ( A - c ) Obehandlad (blå) och T-behandlade (gröna) glasål

från L1 i Storbritannien. ( A ) Andel muskel TDP och muskel T koncentration. ( B ) Lever TK-aktivitet

och latens. ( C ) Lever TK latens och muskel TDP. ( D - i ) Kvinnliga europeiska blankålar på H1, I9,

och J1 i Sverige. ( D ) Lever TK-aktivitet och SUMT. ( e ) Andel vit muskel TDP och vitt

muskel T koncentration. ( F ) Andel hjärnan TDP och hjärna T koncentration. ( G ) Andel levern

TDP och lever T koncentration. ( H ) Hjärna och lever SUMT. ( I ) SG och lever / hjärna SUMT förhållande. ●

OLS: vanliga minsta kvadrat regression. GM: geometriska medelvärdet regression.

Elvers

L1

n = 24

P = 0,022

R ^ = 0,22

50

55

60

65

70

75

80

85

90

95

100

0

0,1

0,2

0,3

0,4

P

ro

p

o

rtio

n

m

u

s

c

le

T

DP

(%)

Muskel T (nmol / g ww)

P = 0,0022

R ^ = 0,22

0

5

10

15

20

25

30

35

40

-5

0

5

10

15

20

25

30

35

Liv

er T

K

växelström

tiv

ity

(nm

ol / m

i / m

g)

Lever TK latens (%)

Obehandlade n = 28

T-behandlad n = 12

OLS

GM

Elvers

L1

P = 0,00011

R ^ = 0,33

-5

0

5

10

15

20

25

30

35

0

5

10

15

Liv

er T

K

sent

nc

y

(%)

Muskel TDP (nmol / g ww)

Obehandlade n = 28

T-behandlad n = 12

OLS

GM

Elvers

L1

I9 2012 n = 4

P = 0,0026

R ^ = 0,99

H1, I9, J1

2013 n = 20

P <0,0001

R ^ = 0,73

0

10

20

30

40

50

60

70

80

0

5

10

15

20

Liv

er T

K

växelström

tiv

ity

(nm

ol / m

i / m

g)

Lever SUMT (nmol / g ww)

blankål

blankål

H1, I9, J1

n = 24

P <0,0001

R ^ = 0,75

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

P

ro

p

o

rtio

n

w

h

ite

m

u

s

c

le

T

DP

(%)

Vit muskel T (nmol / g ww)

blankål

H1, I9, J1

n = 14

P <0,0001

R ^ = 0,78

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

0

2

4

6

8

P

rop

ortion

hjärna T

DP

(%)

Hjärna T (nmol / g ww)

blankål

H1, I9, J1

n = 38

P = 0,0074

R ^ = 0,93

50

55

60

65

70

75

80

85

90

95

100

0

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

P

rop

ortion

liv

er T

DP

(%

)

Lever T (nmol / g ww)

P = 0,024

R ^ = 0,36

blankål

H1, I9, J1

n = 14

0

5

10

15

20

25

0

5

10

15

20

B

regn S

um

T

(nm

ol / gw

w

)

Lever SUMT (nmol / g ww)

P = 0,0013

R ^ = 0,59

blankål

H1, I9, J1

n = 14

0

20

40

60

80

100

120

0

0,5

1

1,5

SG

(G / år

öra)

Lever / hjärna SUMT-förhållande

---

Page 54

54

j

k

l

m

n

o

p

Figur S4 (fortsättning). Europeisk ål ( Anguilla anguilla ). ( J - m ) Kvinnliga europeiska blankål vid

H1, I9 och J1 i Sverige. ( J ) BCI och SG. ( k ) Lever (röd) och vit muskel (orange) SUMT och

ålder. ( L ) Lever / hjärna SUMT förhållande och ålder. ( M ) Lever / hjärna TMP-förhållande och ålder. ( N - p ) Kvinna

Europeiska blankålar på H1 och I9 i Sverige. ( N ) Hematokrit och lever TK-aktivitet. ( O )

Hematokrit och hjärn TK aktivitet. ( P ) Hematokrit och hjärna TK latens.

P <0,0001

R ^ = 0,53

blankål

H1, I9, J1

n = 38

0

2

4

6

8

10

12

14

16

0

50

100

150

B

Cl (k

g / g

)

SG (g / år)

P = 0,0027

R ^ = 0,22

blankål

H1, I9, J1

P = 0,67

R ^ = 0,0084

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

0

5

10

15

20

25

S

um

T

(nm

ol / gw

w

)

Ålder (år)

Levern n = 38

Vit muskel n = 24

P = 0,0046

R ^ = 0,50

blankål

H1, I9, J1

n = 14

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4

0

5

10

15

20

Liv

er / hjärna Sum

T

förhållande

Ålder (år)

P = 0,0016

R ^ = 0,58

blankål

H1, I9, J1

n = 14

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0,9

0

5

10

15

20

Liv

er / hjärna T

MP-förhållande

Ålder (år)

P = 0,019

R ^ = 0,41

blankål

H1, I9

n = 13

0

5

10

15

20

25

30

35

40

0

20

40

60

80

Haem

ato

c

rit (%

)

Lever TK-aktivitet (nmol / min / mg)

P = 0,047

R ^ = 0,31

blankål

H1, I9

n = 13

0

5

10

15

20

25

30

35

40

0

5

10

15

Haem

ato

c

rit (%

)

Hjärn TK-aktivitet (nmol / min / mg)

P = 0,017

R ^ = 0,42

blankål

H1, I9

n = 13

0

5

10

15

20

25

30

35

40

0

5

10

15

20

25

Haem

ato

c

rit (%

)

Hjärnan TK latens (%)

---

Page 55

55

en

b

c

d

e

f

g

h

jag

Figur S5. Atlantlax ( Salmo salar ). ( A , b ) Icke-vickande och vickar vuxna av båda könen

på E1 i Uppsala län och I9 i Blekinge län. ANOVA. ( A ) Lever TK-aktivitet.

( B ) Lever TK latens. ( C - h ) Mogna honor med subletala och letala tiaminbrist (TD) i

deras avkomma på E1 och I9. ANOVA. ( C ) Lever TK-aktivitet. ( D ) Lever TK latens. ( E ) Brain TK

aktivitet. ( F ) Brain TK latens. ( G ) Brain KGDH aktivitet. ( H ) Brain KGDH latens. ( I ) Lever KGDH

aktivitet och latens hos vuxna av båda könen vid E1. ● Bars: aritmetiska medelvärden. Whiskers: 95% CI. C:

kontrollera. OLS: vanliga minsta kvadrat regression. GM: geometriska medelvärdet regression.

C

***

***

0

10

20

30

40

50

60

I9 n = 22

icke-vickar

E1 n = 11

icke-vickar

E1 n = 11

vickar

Liv

er T

K ac

tiv

ity

(nm

ol / m

i / m

g)

Vuxen

atlantisk lax

C

*

***

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

I9 n = 22

icke-vickar

E1 n = 11

icke-vickar

E1 n = 11

vickar

Liv

er T

K

sent

nc

y

(%)

Vuxen

atlantisk lax

C

**

*

0

10

20

30

40

50

60

I9 n = 14

subletal TD

E1 n = 8

subletal TD

E1 n = 3

letal TD

Liv

er T

K ac

tiv

ity

(nm

ol / m

i / m

g)

Vuxen

atlantisk lax

C

*

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

I9 n = 14

subletal TD

E1 n = 8

subletal TD

E1 n = 3

letal TD

Liv

er T

K

sent

nc

y

(%)

Vuxen

atlantisk lax

C

**

***

0

2

4

6

8

10

12

14

I9 n = 14

subletal TD

E1 n = 6

subletal TD

E1 n = 2

letal TD

Brain T

K ac

tiv

ity

(nm

ol / m

i / m

g)

Vuxen

atlantisk lax

C

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

I9 n = 14

subletal TD

E1 n = 6

subletal TD

E1 n = 2

letal TD

B

regn T

K

sent

nc

y

(%)

Vuxen

atlantisk lax

C

**

0

2

4

6

8

10

12

14

I9 n = 14

subletal TD

E1 n = 6

subletal TD

E1 n = 2

letal TD

B

regn K

G

DH ac

tiv

ity

(nm

ol / m

i / m

g)

Vuxen

atlantisk lax

C

**

0

5

10

15

20

25

30

35

40

I9 n = 14

subletal TD

E1 n = 6

subletal TD

E1 n = 2

letal TD

B

regn K

G

DH sent

nc

y

(%)

Vuxen

atlantisk lax

P = 0,011

R ^ = 0,53

Vuxen

atlantisk lax

E1

0

5

10

15

20

25

0

10

20

30

40

Liv

er K

G

DH ac

tiv

ity

(nm

ol / m

i / m

g)

Lever KGDH latens (%)

Honor n = 11

Hanar n = 11

OLS

GM

P = 0,18

R ^ = 0,19

---

Page 56

56

j

k

l

m

n

o

p

q

r

Figur S5 (fortsättning). Atlantlax ( Salmo salar ). ( J ) Egg SUMT och lever TK-aktivitet i

mogna kvinnor på E1 i Uppsala län (orange) och I9 i Blekinge län (röd).

( K - q ) Vuxna av båda könen vid I9. ( K ) Vit muskel SUMT och totalvikt. ( L ) Lever och hjärta

SUMT. ( M ) Lever och hjärna SUMT. ( N ) Hematokrit och lever TK-aktivitet. ( O ) Hematokrit och

hjärna SUMT. ( P ) Erytrocyt hemoglobin och lever TK-aktivitet. ( Q ) Erytrocyt hemoglobin och

heart SUMT. ( R ) Lever TK-aktivitet i larver från n honor vid E1 70 , I9, och K1 166-182 d ° C-tjänst

kläcka. Larver från T-injicerade honorna jämfördes med larver med subletal eller letal tiamin

brist (TD). Z-test. ● Bars: aritmetiska medelvärden. Whiskers: 95% CI. C: kontroll. OLS: vanliga

minsta kvadratregression. GM: geometriska medelvärdet regression.

P = 0,00033

R ^ = 0,44

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

0

20

40

60

80

E

gg

S

um

T

(nm

ol / gw

w

)

Lever TK-aktivitet (nmol / min / mg)

E1 n = 11

I9 n = 14

OLS

GM

Vuxen

atlantisk lax

Vuxen

atlantisk lax

I9 n = 22

P = 0,014

R ^ = 0,26

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

20

0

5

10

15

20

W

hite m

oss

c

le S

um

T

(nm

ol / gw

w

)

Total vikt (kg)

Vuxen

atlantisk lax

I9 n = 22

P = 0,0012

R ^ = 0,42

0

5

10

15

20

25

30

35

0

5

10

15

20

25

Liv

er S

um

T

(nm

ol / gw

w

)

Heart SUMT (nmol / g ww)

OLS

GM

Vuxen

atlantisk lax

I9 n = 22

P = 0,0073

R ^ = 0,31

0

5

10

15

20

25

30

35

0

5

10

15

20

25

Liv

er S

um

T

(nm

ol / gw

w

)

Hjärnan SUMT (nmol / g ww)

OLS

GM

Vuxen

atlantisk lax

I9 n = 22

P = 0,027

R ^ = 0,22

0

10

20

30

40

50

60

0

20

40

60

80

Haem

ato

c

rit (%

)

Lever TK-aktivitet (nmol / min / mg)

Honor n = 14

Hanar n = 8

Vuxen

atlantisk lax

I9 n = 22

P = 0.00010

R ^ = 0,54

0

10

20

30

40

50

60

0

5

10

15

20

25

Haem

ato

c

rit (%

)

Hjärnan SUMT (nmol / g ww)

Vuxen

atlantisk lax

I9 n = 22

P = 0,021

R ^ = 0,24

0

50

100

150

200

250

300

350

400

0

20

40

60

80

E

ry

th

ro

c

y

te

h

en

e

m

o

g

lo

b

i

(g

/ L

)

Lever TK-aktivitet (nmol / min / mg)

Vuxen

atlantisk lax

I9 n = 22

P = 0,016

R ^ = 0,26

0

50

100

150

200

250

300

350

400

0

5

10

15

20

25

E

ry

th

ro

c

y

te

h

en

e

m

o

g

lo

b

i

(g

/ L

)

Heart SUMT (nmol / g ww)

C

**

*

**

***

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

4

4,5

5

E1 1997

T-inj.

n = 4

I9 2012

sub-Leth.

TD n = 10

K1 2012

sub-Leth.

TD n = 6

E1 1997

sub-Leth.

TD n = 4

E1 1997

dödlig

TD n = 4

Liv

er T

K

växelström

tiv

ity

(nm

ol / m

in / liv

er)

atlantisk lax

larver

---

Page 57

57

s

t

u

Figur S5 (fortsättning). Atlantlax ( Salmo salar ). ( S ) Lever TK-aktivitet och latens i larver

från n honor vid I9 och K1 166-180 d ° C efter kläckning. ( T , u ) Frekvens av vuxna honor med

tiamin-brist-inducerad mortalitet hos larverna. ( T ) genomsnitt Östersjön baserat på 08:59

floder 1974-2016. ( U ) Nio svenska floder. Kartan skapades med GIMP 2.8.16

( http://www.gimp.org/downloads/ ).

P = 0,039

R ^ = 0,27

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

4

4,5

0

10

20

30

40

50

Liv

er T

K

växelström

tiv

ity

(nm

ol / m

in / liv

er)

Lever TK latens (%)

I9 n = 10

K1 n = 6

atlantisk lax

larver

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

1970

1975

1980

1985

1990

1995

2000

2005

2010

2015

2020

F

em

ale

w

: te Thiam

ine

de

fic

ien

c

y

-Ind

uc

ed

m

o

rta

lity

i

th

e

la

rv

en

e

(%)

kläckning år

atlantisk lax

Östersjön:

genomsnitt

1-9 floder

n = 28.948

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

1970

1975

1980

1985

1990

1995

2000

2005

2010

2015

2020

F

em

ale

w

: te Thiam

ine

de

fic

ien

c

y

-Ind

uc

ed

m

ortality

i

larv

ae

(%)

kläckning år

1 River Lule 1987-2016 n = 8495

2 River Skellefte 1987-2016 n = 1579

3 River Umeälven 1985-2016 n = 2035

4 Ångermanälven 1987-2016 n = 3148

5 River Indals 1974-2016 n = 6888

6 River Ljungan 1988-2002 n = 214

7 Ljusnan 1986-2016 n = 2716

8 Dalälven 1985-2016 n = 3321

9 Mörrumsån 1985-1997 n = 552

atlantisk lax

---

Page 58

58

en

b

c

d

e

f

Figur S6. Sill ( Clupea harengus ). Vuxna honor (orange) och män (grön) vid I8 i

Blekinge län. Fem av sex linjära regressioner för de sammanslagna könen var obetydliga. ( A )

Proportion lever TDP och lever T koncentration. ( B ) Andel hjärnan TDP och hjärna T

koncentration. ( C ) Lever TK-aktivitet och latens. ( D ) Brain TK-aktivitet och latens. ( E ) Lever

KGDH aktivitet och latens. ( F ) Brain KGDH aktivitet och latens.

P = 0,18

R ^ = 0,094

I8

50

55

60

65

70

75

80

85

90

95

100

0

0,2

0,4

0,6

0,8

P

rop

ortion

liv

er T

DP

(%)

Lever T (nmol / g ww)

Honor n = 9

Hanar n = 12

P = 0,10

R ^ = 0,27

I8

80

81

82

83

84

85

86

87

88

89

90

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

P

rop

ortion

hjärna T

DP

(%)

Hjärna T (nmol / g ww)

Honor n = 5

Hanar n = 6

P = 0,0041

R ^ = 0,36

I8

0

10

20

30

40

50

60

70

80

-10

-5

0

5

10

Liv

er T

K

växelström

tiv

ity

(nm

ol / m

i / m

g)

Lever TK latens (%)

Honor n = 9

Hanar n = 12

P = 0,076

R ^ = 0,34

I8

0

2

4

6

8

10

12

-5

0

5

10

B

regn T

K

växelström

tiv

ity

(nm

ol / m

i / m

g)

Hjärnan TK latens (%)

Honor n = 4

Hanar n = 6

P = 0,56

R ^ = 0,018

I8

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

20

-10

-5

0

5

10

Liv

er K

G

DH ac

tiv

ity

(nm

ol / m

i / m

g)

Lever KGDH latens (%)

Honor n = 9

Hanar n = 12

P = 0,30

R ^ = 0,15

I8

0

5

10

15

20

25

30

-5

0

5

10

15

20

B

regn K

G

DH ac

tiv

ity

(nm

ol / m

i / m

g)

Hjärnan KGDH latens (%)

Honor n = 3

Hanar n = 6

---

Page 59

59

Figur S7A. En typisk tamhöns ( Gallus gallus ) lever kromatogrammet. tiamin

monofosfat (TMP) och tiamin difosfat (TDP) koncentrationer var nästan lika och

icke fosforylerad tiamin (T) koncentrationen var jämförelsevis hög, även lägre än den

TMP och TDP koncentrationer.

en

rbitrary

u

nits

Minuter

T

TMP

TDP

---

Page 60

60

Figur S7B. En typisk blåmusslor (Mytilus sp.) Mjuk kropps kromatogrammet. tiamin

monofosfat (TMP) och tiamin difosfat (TDP) eluerade såsom angivits, medan icke-

fosforylerat tiamin (T) var inte detekterbar. Typiska, manuellt dragna, baslinjer för

kvantifiering visas i rött.

Godtycklig

enheter

Minuter

T

TMP

TDP

---

Page 61

61

Figur S7c. En atypisk blåmusslor (Mytilus sp.) Mjuka kropps kromatogram med interfererande

toppar. Icke-fosforylerat tiamin (T), tiamin monofosfat (TMP) och tiamin

difosfat (TDP) toppar (grön) identifierades genom standardtillsats (blå) och extern standard

(brun). Det fanns ingen baslinjen separation för T och TMP toppar. TMP topp syntes endast

som en skuldra hos en interfererande topp. Varken T eller TMP-koncentrationen var möjligt att kvantifiera

i detta prov.

Godtycklig

enheter

Minuter

T

TMP

TDP

Föra in

---

Sidan 62

62

Figur S7d. Jämförelse av tiamin kvantifiering av yttre standard kontra standard

tillägg. Icke-fosforylerat tiamin (T), tiamin monofosfat (TMP) och tiamin

difosfat (TDP) kvantifierades i en homogen blåmusslor ( Mytilus sp. ) mjuk kropp

referensmaterial. Kvantifiering genom extern standard och standardtillsats gav ekvivalent

resultat, bekräftat genom statistisk testning av lutningen och skärningen av regressionslinjerna. Backen

skilde sig inte från en och skärnings skilde sig inte från 0. Således denna kvalitetssäkring

experiment visade en mycket god kvantifiering av tiamin och certifierade att tiamin toppar

identifierades korrekt.

y = 1.181x - 0,002

P <0,0001

R ^ = 0,998

0

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

0

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

T

(nm

ol / s

är

pel)

qu

en

titated

av

ex

tern s

solbränna

da

rd

T (nmol / prov) kvantifierades genom standardtillsats

y = 0.835x - 0,005

P <0,0001

R ^ = 0,990

0

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

0

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

0,3

T

MP

(nm

ol / s

är

pel)

qu

en

titated

av

ex

tern s

solbränna

da

rd

TMP (nmol / prov) kvantifierades genom standardtillsats

y = 1.139x - 0,044

P <0,0001

R ^ = 0,983

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7